石雪峰，王立生，格日力

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低氧對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響

石雪峰，王立生，格日力

作者單位：810001 西寧，青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院高原醫(yī)學(xué)研究中心（石雪峰、格日力）；100850 北京，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所（石雪峰、王立生）；810001 西寧，青海省人民醫(yī)院呼吸科（石雪峰）

近年來，大量研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMMSCs）是一群具有多向分化潛能、低免疫原性的多能干細(xì)胞，在一定的誘導(dǎo)條件下能最終分化成心肌、骨、軟骨、神經(jīng)等多種組織，易于在體外分離培養(yǎng)，并易于為外源基因轉(zhuǎn)染和表達(dá)。這些特性使BMMSCs 成為在細(xì)胞治療、基因治療中有效發(fā)揮療效的理想工程細(xì)胞，展示了其作為一種新的理想干細(xì)胞來源在治療多種缺血缺氧性疾病中的良好應(yīng)用前景［1-3］。但骨髓中BMMSCs 含量極其稀少，研究顯示，BMMSCs 在新生兒骨髓單個核細(xì)胞中占 0.01%，隨著年齡增大，數(shù)量逐漸降低，到 80 歲僅占 0.00005%［4］。而應(yīng)用于臨床治療的干細(xì)胞每次需要 5 千萬 ～ 2 億個，這不可能從一個捐獻(xiàn)者體內(nèi)分離獲得［5-7］，而是需要進(jìn)行體外擴(kuò)增。但是，BMMSCs 體外增殖亦較慢，因此，如何實現(xiàn)少量取樣，批量獲取是 BMMSCs滿足臨床試驗研究的當(dāng)務(wù)之急。BMMSCs 的自我更新受多種復(fù)雜微環(huán)境的調(diào)控，如細(xì)胞間的接觸、各種蛋白及生長因子等，而微環(huán)境中的氧張力是調(diào)控 BMMSCs 功能的重要因素［8］。早在 1958 年，Cooper 等［9］發(fā)現(xiàn)在低氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞時，細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)。骨髓中氧張力僅為 1% ～6%［10-13］，因此，推測低氧可能更適合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)。另外，當(dāng)缺血性心臟病、缺血性腦病等發(fā)生時，局部損傷器官多處于低氧微環(huán)境中，局部氧濃度可低于0.2%［14-15］，BMMSCs 移植后療效的發(fā)揮與損傷部位的低氧環(huán)境密切相關(guān)。因此，開展低氧條件對間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的研究對于 BMMSCs 的應(yīng)用具有非常重要的意義。

1　低氧對 BMMSCs 增殖能力的影響

隨著干細(xì)胞治療技術(shù)的發(fā)展，如何提高 BMMSCs 增殖效率成為 BMMSCs 移植治療的關(guān)鍵。2007 年，F(xiàn)ehrer等［16］研究發(fā)現(xiàn)，與常氧培養(yǎng) BMMSCs 相比，3% 氧濃度培養(yǎng)使 BMMSCs 增殖效率提高約 10 倍。2010年，Dos Santos 等［8］研究發(fā)現(xiàn)，在 2% 的低氧條件下培養(yǎng)BMMSCs，其增殖效率明顯優(yōu)于常氧條件，并能很好地維持其免疫原性及分化潛能，研究認(rèn)為這可能與低氧條件下細(xì)胞代謝效率提高有關(guān)。Estrada 等［17］同樣證明，3% 氧濃度下培養(yǎng)可以明顯提高 BMMSCs 增殖效率。研究發(fā)現(xiàn)，同等數(shù)量的 BMMSCs 在低氧條件下培養(yǎng)到第五代時可獲得 1 × 109個細(xì)胞，而在常氧條件下培養(yǎng)僅能得到 2 × 107個?？傊脱蹩梢源龠M(jìn) BMMSCs 的增殖，但是其機(jī)制目前尚不明確，可能與 Oct-4 和 Rex-1 表達(dá)升高有關(guān)［18］，也可能是通過上調(diào) HIF-1α 或 HIF-2α 表達(dá)［19］。

2　低氧對 BMMSCs 分化潛能的影響

除了 BMMSCs 的增殖能力，BMMSCs 的分化潛能在干細(xì)胞治療中也有著舉足輕重的地位，已有研究發(fā)現(xiàn)，1% ～5% 氧張力可以維持 BMMSCs 的多向分化潛能。Raheja等［20］研究發(fā)現(xiàn)，21% 的氧張力與 1%、2%、5% 的氧張力相比具有更高的成骨分化潛能，低于 5% 的氧張力可以抑制 BMMSCs 的分化潛能。Holzwarth 等［21］研究發(fā)現(xiàn)相對于常氧培養(yǎng)，1% 氧張力可抑制 BMMSCs 的成脂、成骨分化潛能。當(dāng)氧張力升高到 3% 時，可以恢復(fù)其成骨分化潛能。Basciano 等［22］研究發(fā)現(xiàn)，相對于常氧培養(yǎng)，5% 氧張力可以促進(jìn)第二代 BMMSCs 成骨及成脂分化?？傊?，目前部分研究者認(rèn)為低氧抑制 BMMSCs 的成骨分化［23-24］，而另有研究者認(rèn)為低氧可促進(jìn) BMMSCs 成骨分化潛能而抑制其成脂分化［25］。因此，目前關(guān)于低氧對 BMMSCs 分化潛能的影響頗有爭議［26］。

3　低氧對 BMMSCs 遷移能力的影響

可遷移至損傷局部是 BMMSCs 應(yīng)用于干細(xì)胞治療的另一重要特性。BMMSCs 遷移依賴于不同細(xì)胞因子與其受體的結(jié)合，如基質(zhì)細(xì)胞衍生因子 1（stromal cell-derived factor 1，SDF-1）/CXC 趨化因子受體 4（CXC chemokine receptor-4，CXCR4）、干細(xì)胞因子（SCF）-c-Kit、肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）/c-Met、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）/VEGFR、血小板衍生因子（platelet derived growth factor，PDGF）/PDGFR、單核細(xì)胞趨化蛋白 1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）/CC 類趨化因子受體 2（C-C motif chemokine receptor-2，CCR2）以及高遷移率族蛋白 1（high mobility group box-1 protein，HMGB1）/晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation endproducts，RAGE）等［27］。已有研究表明，低氧預(yù)處理 BMMSCs 有利于干細(xì)胞的遷移。Annabi 等［28］研究發(fā)現(xiàn)，低氧微環(huán)境可以快速誘導(dǎo)BMMSCs 的遷移，并且可以降低基質(zhì)金屬蛋白酶 2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）的表達(dá)及分泌，明顯提高膜1 型 MMP（membrane-type1-MMP，MT1-MMP）的表達(dá)，提示低氧可通過促進(jìn) BMMSCs 表達(dá) MT1-MMP 提高其遷移能力。Liu 等［29］研究發(fā)現(xiàn)，低氧可誘導(dǎo) BMMSCs 低氧誘導(dǎo)因子 1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）表達(dá)，后者作用于下游基因 VEGF 和 SDF-1α，促進(jìn) BMMSCs的遷移。多項研究同樣認(rèn)為低氧可能通過上調(diào) SDF-1α、CXCR4、RhoA 或 HIF-1α 的表達(dá)從而促進(jìn) BMMSCs 的遷移［29-31］。

4　低氧對 BMMSCs 分泌能力的影響

早在 1963 年就有研究發(fā)現(xiàn)，BMMSCs 可以合成細(xì)胞因子、生長因子等釋放到微環(huán)境中發(fā)揮對其他細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用［32］。大量文獻(xiàn)表明，短期低氧預(yù)處理 BMMSCs 可以促進(jìn) VEGF、HGF、PDGF、bFGF 等表達(dá)，從而發(fā)揮促進(jìn)血管生成的作用［33-35］。Hu 等［36］研究發(fā)現(xiàn)，低氧可以促進(jìn)血管生成素 1 及促紅細(xì)胞生成素等微血管形成相關(guān)因子的表達(dá)。另外，還有研究表明低氧可以促進(jìn) BMMSCs 分泌腫瘤壞死因子 α、IL-10 等炎性因子［37］，IL-10 可以抑制心肌缺血缺氧條件下心肌纖維母細(xì)胞增殖以及膠原蛋白的合成，從而發(fā)揮保護(hù)心肌以及抑制局部炎癥反應(yīng)的作用。Chen 等［38］將 BMMSCs 移植到小鼠心梗移行區(qū)，檢測心肌促炎因子（IL-1β、IL-6、IL-8）以及抗炎因子（IL-10）的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在心肌缺血缺氧局部微環(huán)境下，BMMSCs 可以降低心肌促炎因子與抗炎因子的比率，從而發(fā)揮抑制局部炎癥反應(yīng)的作用。由此我們認(rèn)為，低氧條件下 BMMSCs 的旁分泌功能明顯高于常氧培養(yǎng)，細(xì)胞可分泌更多的血管生長因子、抗炎因子等活性物質(zhì)發(fā)揮組織修復(fù)功能。

5　低氧對 BMMSCs 凋亡的影響

目前，BMMSCs 移植到缺血缺氧心肌局部后在數(shù)天內(nèi)大量死亡也是干細(xì)胞治療需要解決的重要問題［39］。Chacko等［34］以 0.5% 氧濃度分別預(yù)處理 BMMSCs 24、48 和72 h，發(fā)現(xiàn)低氧預(yù)處理 BMMSCs 可以抑制其凋亡，促進(jìn)其存活、血管生成、分化等能力，并且低氧預(yù)處理 24 h 效果明顯優(yōu)于預(yù)處理 72 h。Maslov 等［39］研究顯示，低氧預(yù)處理可以保護(hù)移植 BMMSCs 歸巢到缺血心肌局部后的長期低氧及氧化應(yīng)激反應(yīng)所致的凋亡，從而發(fā)揮減少心梗面積、促進(jìn)梗死后心肌重建等組織修復(fù)功能。

6　低氧對 BMMSCs 基因穩(wěn)定性的影響

BMMSCs 的基因不穩(wěn)定性是干細(xì)胞治療安全性的主要問題，例如 BMMSCs 在體外擴(kuò)增及進(jìn)入體內(nèi)后出現(xiàn)的染色體數(shù)目異常（非整倍體）、DNA 降解、端粒縮短等問題［40-41］。已有研究發(fā)現(xiàn)，常氧培養(yǎng)細(xì)胞可以導(dǎo)致 DNA 損傷從而導(dǎo)致細(xì)胞衰老及失去活力［17， 42-43］。Oliveira 等［44］研究發(fā)現(xiàn)，低氧可以迅速降低 DNA 損傷相關(guān)基因的表達(dá)及染色體數(shù)目異常，促進(jìn)微衛(wèi)星的不穩(wěn)定性及維持端粒的長度。研究還發(fā)現(xiàn)，低氧不影響 BMMSCs 線粒體基因組的完整性。Fan等［45］同樣發(fā)現(xiàn)，常氧（20%）條件下培養(yǎng) BMMSCs 出現(xiàn)廣泛的染色體異常，而低氧可以降低其氧化性損傷，聯(lián)合抗氧化劑α-苯丁酰硝酮和 N-乙酰半胱氨酸可以進(jìn)一步降低DNA 損傷及染色體異常，并可以促進(jìn) BMMSCs 的增殖。但是也有研究發(fā)現(xiàn)，被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的主要因素的染色體數(shù)目異常，受供體影響而不是受培養(yǎng)環(huán)境中氧張力的影響［40］。

7　結(jié)語與展望

綜上，低氧預(yù)處理（氧張力 0.5% ～ 5%）BMMSCs 可以作為一種有效方法在一定程度上克服 BMMSCs 的增殖緩慢、移植后遷移率低、基因不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，提高其臨床應(yīng)用的有效性及安全性，對再生醫(yī)學(xué)的研究有至關(guān)重要的意義。另外，關(guān)于 BMMSCs 在低氧條件下的分化能力爭議頗多，這可能與不同培養(yǎng)環(huán)境的氧張力、BMMSCs 的傳代次數(shù)、細(xì)胞狀態(tài)等有關(guān)。總之，雖然目前低氧對 BMMSCs 調(diào)控作用還缺乏一致性，特別是低氧對其分化能力的影響，但低氧對 BMMSCs 的生物學(xué)特性的影響及其在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用是不可忽視的。氧張力對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響在一系列的影響因素中最為突出，且通過控制氧張力來影響細(xì)胞的生物學(xué)行為簡單易行。但臨床實踐中仍有很多問題需要解決：①氧張力的最佳比例和最適培養(yǎng)時間的確定；②低氧對BMMSCs的調(diào)控機(jī)制是什么？其調(diào)節(jié)作用是否受傳代次數(shù)及凍存后復(fù)蘇的影響；③低氧預(yù)處理后，BMMSCs 體內(nèi)致瘤性等問題?？傊?，低氧環(huán)境對 BMMSCs 生理特性及作用機(jī)制的影響研究具有重要意義，或可為解決缺血缺氧性疾病提供新的思路。

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·協(xié)會之窗·

DOI：10.3969/j.issn.1673-713X.2016.03.011

基金項目：國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973 計劃）（2012CB518205）；國家自然科學(xué)基金（81573086、31160219、31571231）

通信作者：格日力，Email：geriligao@hotmail.com

收稿日期：2016-01-12