朱雪玲綜述，蘇占海審校

(1.青海大學研究生院；2.青海大學醫(yī)學院基礎醫(yī)學部，青海 西寧 810001)

低氧對間充質干細胞生物學功能的影響

朱雪玲1綜述，蘇占海2#審校

(1.青海大學研究生院；2.青海大學醫(yī)學院基礎醫(yī)學部，青海 西寧 810001)

間充質干細胞(MSC)具有自我更新、多向分化、免疫抑制的特性，MSC的這些生物學特性受氧濃度、溫度等多種因素的影響。氧對于幾乎所有的生命都是必需的，它維持細胞的能量代謝及功能。生理條件下各組織細胞生存環(huán)境的氧體積分數不同，人體血液中氧體積分數為10%～13%，軟骨細胞(無血管組織)氧體積分數為0%～7%，腦組織氧體積分數為3%～14%，肺泡血管氧體積分數為14%，骨髓腔內氧體積分數為1%～7%[1]。但目前對于MSC生理特性的體外研究主要在常氧(氧體積分數為21%)條件下進行，這并不符合細胞的生理狀態(tài)，因此研究者提出了在低氧條件下進行細胞體外培養(yǎng)的觀點[1]。20世紀90年代低氧誘導因子的發(fā)現使人們對低氧對機體的影響有了新的認識。低氧可能會影響細胞周期、細胞凋亡、細胞分化[2～5]。MSC可向骨組織、軟骨組織、脂肪細胞、心肌細胞、神經細胞分化，具有免疫抑制特性，進行MSC移植后可引起較輕的免疫反應。因此，MSC移植在創(chuàng)傷修復、心肌梗死、腦梗、肺纖維化及神經系統(tǒng)退行性疾病等的治療中有一定的應用前景[3]。MSC主要來源于骨髓，髓腔中的低氧環(huán)境恰是MSC生長的正常環(huán)境，本文對低氧對MSC凋亡、遷移、增殖、分化的影響綜述如下。

1 低氧對MSC凋亡的影響

將MSC置于適當的低氧環(huán)境下培養(yǎng)可抑制其凋亡，當培養(yǎng)MSC的氧濃度過低時會使其發(fā)生凋亡。京都大學教授山中伸彌等在多能干細胞研究過程中發(fā)現多能干細胞總是集中于氧濃度相對較低的地方。于是，他們把培養(yǎng)多能干細胞的f從21%降至5%，發(fā)現多能干細胞的數量是之前的2.5～4.2倍。繼續(xù)降低培養(yǎng)多能干細胞時的氧濃度，當氧體積分數降低至1%時部分細胞發(fā)生凋亡[6]。Ejtehadifar M等研究發(fā)現當培養(yǎng)MSC的氧體積分數為2.5%時可抑制其凋亡，氧體積分數為1.5%時促使MSC凋亡，但此時發(fā)生凋亡的MSC數少于常氧時發(fā)生凋亡的MSC數，培養(yǎng)MSC的氧體積分數過低會對其造成損傷，這可能與細胞的能量供應降低有關[7]。在一定時間內，氧濃度過低條件下培養(yǎng)的MSC凋亡率大于常氧條件，顯示凋亡率增加可能與機體暴露于低氧環(huán)境有關。Tielong Chen等研究顯示，將MSC放在極低氧(氧體積分數小于0.5%)環(huán)境下培養(yǎng)6 h后轉至常氧條件下培養(yǎng)12 h，有活性的細胞數明顯增加；若將MSC置于極低氧環(huán)境下培養(yǎng)24 h后移至常氧條件下培養(yǎng)24 h其凋亡指數升高[8]。低氧抑制MSC凋亡的機制包括以下三方面：(1)Ping Hua等在低氧環(huán)境下對小鼠的骨髓間充質干細胞(BMSC)進行培養(yǎng)，采用western blot檢測細胞中天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白水解酶-3(caspase-3)的表達，結果發(fā)現細胞中caspase-3沉默后，caspase-3在mRNA水平上的表達下調，Bcl-2表達上調，Bax表達下調，Bcl-2/Bax增高，進而抑制BMSC的凋亡[9]；(2)Mona El Refaey等研究發(fā)現低氧條件下通過激活信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)，抑制MSC凋亡[10]；(3)Sun Mi Palumbo等研究發(fā)現低氧條件下巨噬細胞遷移抑制因子(MIF)表達上調，抑制Akt信號通路，增加細胞衰老相關β-半乳糖的活性，增加細胞衰老標記分子P16和P21的轉錄水平，減少NANOG，OCT3/4(otcamer3/4)和SOX2等的表達，抑制細胞凋亡。同時，低氧條件下MIF持續(xù)過表達可激活Akt信號通路進而抑制細胞凋亡[11，12]。Tielong Chen等研究發(fā)現，進行MSC培養(yǎng)時的氧濃度過低使其凋亡的機制為：氧濃度過低時細胞色素c從線粒體的內膜遷移至基質中干擾細胞的能量代謝，通過caspases依賴性細胞凋亡的內源性途徑使細胞發(fā)生凋亡[8]。

2 低氧對MSC遷移的影響

低氧對MSC遷移能力的影響目前還存在一些爭議，大多數研究結果表明低氧可促進MSC的遷移，但也有與之相反的研究結果。朱潔等在低氧對人骨髓間充質干細胞(hBMSC)趨化因子受體4(CXCR4)和趨化因子受體1(CXCR1)表達影響的研究中，采用Western blot檢測發(fā)現低氧條件下培養(yǎng)的hBMSC中CXCR4和CXCR1表達上調，免疫組化檢測發(fā)現相應配體表達增加，低氧可促進其遷移[13]。Hong-lei Xie等研究發(fā)現，在低氧條件下培養(yǎng)的MSC中低氧誘導因子1α(HIF-1α)的表達上調，從而使與細胞遷移有關的基質細胞衍生因子1(SDF-1)表達增加，進而使CXCR4表達增加，通過HIF-1α-SDF-1通路或SDF-1-CXCR4通路促進MSC遷移[14]。Yahaira Naaldijk等研究發(fā)現，在氧體積分數為1%的低氧環(huán)境下培養(yǎng)MSC可促進其分泌腫瘤壞死因子α(TNF-α)、血小板衍生生長因子(PDGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)及干擾素γ(IFN-γ)等細胞因子，進而促進MSC遷移，其中以IFN-γ的作用最為突出[15]。Vertelov G等研究發(fā)現在低氧條件下生長因子(HGF，EGF，VEGF-121，bFGF)、粘附分子(BCA-1，RANTES)、炎性細胞因子(SDF-1α，IL-1β，IL-6，TNF-α)可促進hMSC遷移[16]。Lakatos K等研究結果發(fā)現，低氧條件下培養(yǎng)的MSC中甘油三酯、脂肪酸、二酯酰甘油(DG)的含量明顯增加，應用磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C抑制劑D609轉染MSC可減少細胞中DG的含量，抑制MSC分泌血管內皮細胞生長因子(VEGF)和血管緊張素Ⅱ(Ang II)，但可增加白細胞介素-8(IL-8)的分泌，從而抑制血管內皮細胞向損傷部位遷移，間接說明低氧可促進MSC遷移[17]。Leah F.Raheja等研究結果發(fā)現，在低氧環(huán)境下培養(yǎng)的MSC中HIF-1α和小G蛋白超家族的亞家族成員RhoA的表達增加，可減少細胞骨架(主要是微絲)的數量，抑制間充質干細胞的遷移。微絲的組裝是依賴GTP的，在氧體積分數為1%的低氧環(huán)境下培養(yǎng)的MSC細胞中HIF-1α、RhoA表達增加使GTP大量水解，GTP含量降低，進而抑制微絲的組裝。同時，MSC中HIF-1α、RhoA表達增加時，微絲解聚因子絲切蛋白(cofilin)和LIM激酶表達增加，微絲解聚。由于上述原因微絲的數量減少，從而抑制細胞遷移[18]。

3 低氧對MSC增殖的影響

MSC主要來源于骨髓，髓腔內的氧體積分數為1%～7%[1]，髓腔中的這種低氧環(huán)境恰好是MSC生長的正常環(huán)境。目前多數研究表明低氧可促進MSC的增殖，但也有研究表明低氧促進MSC增殖的作用具有時間依賴性。D′Ippolito等將BMSCs置于氧體積分數為3%的環(huán)境下培養(yǎng)3天后的細胞總數比在常氧下培養(yǎng)7天多3倍[19]。Maria M等研究發(fā)現，生物玻璃注入小鼠體內7天后可在局部形成穩(wěn)定的低氧環(huán)境，此時該部位MSC的數量與對照組相比明顯增加[20]。蔣能剛等在低氧、無血清培養(yǎng)對人BMSC增殖、凋亡影響的研究中發(fā)現，低氧可促進BMSC的增殖[21]。王立偉研究發(fā)現，在氧體積分數為20%的條件下培養(yǎng)BMSC細胞周期停滯于S期的細胞數比在氧體積分數為1%條件下的細胞數多[22]，說明低氧有利于MSC的增殖。鐘啟在低氧對臍帶MSC增殖及差異蛋白表達譜影響的研究中發(fā)現，在低氧條件下培養(yǎng)人臍帶MSC時，人臍帶MSC以G0/G1期細胞為主，占89.4%，處于G2期細胞為4.1%，處于S期的細胞為3.7%，低氧條件下人臍帶MSC增殖活躍[23]。有研究表明，低氧促進MSC增殖的作用呈現時間依賴性。黃永燦等研究發(fā)現，在低氧和常氧條件下培養(yǎng)MSC 6 h～12 h，常氧組的細胞數多于低氧組，培養(yǎng)12 h～24 h時，低氧組的細胞數多于常氧組，培養(yǎng)24 h以上常氧組細胞數多于低氧組[24]。宋瑋瑋用氯化鈷(CoCl2)模擬低氧環(huán)境研究低氧對MSC增殖的影響發(fā)現，將相同濃度CoCl2加入培養(yǎng)基中后的第1天至第6天處理組與對照組相比MSC出現明顯的增殖，第7天MSC的增殖效應消失[25]。低氧促進MSC增殖的機制：(1)Lanfang等應用基因敲除技術說明在低氧條件下HIF-1α可激活apelin/APJ/autophagy信號通路以利于MSC的增殖[26]。(2)何睿智等研究發(fā)現在低氧條件下MSC的增殖能力顯著提高，主要受HIF-TWIST通路、細胞外信號調節(jié)激酶(ERK)的調控[27]。Mona El Refaey等研究發(fā)現低氧條件下主要通過促進ERK的磷酸化促進細胞增殖[10]。(3)Yujuan Zhang等研究發(fā)現在氧體積分數為3%低氧條件下培養(yǎng)MSC可增加內源性AngⅡ、p-Akt在MSC中的表達，但二者的含量變化不是同步的。在內源性AngⅡ表達增加時血管緊張素Ⅱ受體1(AT1R)的表達也隨之增加，且內源性AngⅡ可促進MSC的增殖。進而說明氧體積分數為3%時腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAS軸)可能有促進MSC增殖的作用[28]。

4 低氧對MSC分化的影響

MSC具有多向分化的能力，在進行多向分化的過程中受溫度、培養(yǎng)基成分、氧濃度等多種因素的影響，下面主要討論低氧對MSC多向分化的影響。

4.1 低氧對MSC成骨分化的影響

目前關于低氧對MSC成骨分化的影響尚無統(tǒng)一的看法。部分研究結果表明低氧可促進間MSC成骨分化，部分結果則與之相反。成骨細胞增殖、分化及基質的骨化是成骨分化過程的重要階段。與MSC成骨分化有關的蛋白主要有骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2)、股骨核心結合因子-A1(CBFA1)、Runt相關轉錄因子2(Runx2)和Oxterix。Sonia Prado Lopez等研究發(fā)現，在5%的低氧下培養(yǎng)MSC可增加細胞中BMP2，Runx2，Oxterix的表達，同時也可增加骨細胞成熟標志蛋白骨橋蛋白的表達。此外，與常氧組相比，在5%的低氧環(huán)境下培養(yǎng)的MSC基質中鈣的蓄積量可增加2倍[29，30]。Hao Ding等研究發(fā)現，在低氧條件下短時間培養(yǎng)MSC可抑制Runx2在MSC的表達，但可使MSC中堿性磷酸酶(ALP)的表達增加，說明低氧可促進MSC的成骨分化[31～36]。Chen X等研究發(fā)現，在低氧條件下培養(yǎng)MSC可上調miR-199a-5p在MSC中的表達，激活HIF1α-Twist1通路在MSC成骨分化的早期起促進作用，在骨成熟階段，下調miR-199a-5p在MSC中的表達，抑制HIF1α-Twist1通路促進骨成熟[37]。上述研究表明，低氧可促進MSC成骨分化。趙強等研究結果發(fā)現，在低氧條件下培養(yǎng)MSC可抑制MSC中CBFA1，BMP和骨橋蛋白及血管內皮細胞生長因子(VEGF)的表達，其中對CBFA1和BMP的抑制更為明顯，從而抑制MSC成骨分化[38，39]。Nian Zhoua等研究發(fā)現，在低氧條件下培養(yǎng)MSC使HIF-1α在MSC中的表達增加，HIF-1α在抑制MBP-2誘導的早期成骨相關蛋白Runx2的表達及alp和col1a1基因轉錄的同時抑制骨橋蛋白的表達，進而抑制MSC成骨分化[40]。

4.2 低氧對MSC成軟骨分化的影響

由于成人體內軟骨祖細胞缺乏且其自我再生能力較弱，MSC的成軟骨分化對MSC移植治療大范圍軟骨損傷有重要意義。調節(jié)MSC成軟骨分化的基因有503個，在MSC成軟骨化的過程中起關鍵作用的為轉化生長因子β-1(TGF-β1)、Ⅱ型膠原纖維(COLⅡ)、Sox9(SRY-reiated highmobility group-bos gene9)等基因。此外還有一些與合成代謝相關的基因，如成纖維細胞生長因子受體3(FGFR3)、甲狀旁腺激素受體1(PTH1R)。Leijten J等研究發(fā)現，在低氧條件下培養(yǎng)的MSC中成軟骨化關鍵基因及與合成代謝相關的基因的表達均上調，可促進MSC成軟骨分化[41，42]。曾文等在低氧對BMSC多向分化能力影響的研究中發(fā)現，采用基因敲除的方法對VHL基因條件性敲除并設對照，基因敲除組HIF-1α mRNA的表達顯著增加，經成軟骨分化誘導21天后進行堿性磷酸酶(ALP)染色、鏡檢，結果發(fā)現敲除組ALP染色比對照組深，說明低氧可促進MSC成軟骨分化[43]。

4.3 低氧對MSC成血管分化的影響

機體在進行創(chuàng)傷修復的早期局部組織常處于缺血、缺氧的狀態(tài)，盡快恢復創(chuàng)傷部位的血供有利于創(chuàng)傷修復。血管上皮細胞具有良好的再生能力，在干細胞移植過程中促進MSC分化為血管上皮細胞可盡早恢復局部血供，從而提高移植成功率。麻黃堿受體A3(EphA3)、內皮素-1(Endothelin-1)、血管內皮轉化生長因子A(VEGF-A)、血管內皮轉化生長因子B(VEGF-B)、血管內皮轉化生長因子C(VEGF-C)、血管內皮轉化生長因子D(VEGF-D)是影響血管生成的主要分子，其中Endothelin-1、VEGF-A、VEGF-B促進血管增殖，VEGF-C、VEGF-D促進血管生長。Catherine To.等研究表明，低氧培養(yǎng)MSC可增加EphA3及其配體肝配蛋白A1(ephrin-A1)和肝配蛋白A3(ephrin-A3)在MSC中的表達，促進其成血管分化[44]。Joseph Paquet等研究發(fā)現，在低氧條件下VEGF-A、VEGF-C表達增加有利于血管的生成[45]。Yue Fan等研究發(fā)現，在低氧條件下培養(yǎng)MSC可通過Akt信號通路和絲裂原活化蛋白激酶-細胞外信號調節(jié)蛋白激酶(MER-ERK)信號通路，促進MSC中VEGF的表達，促進血管的增殖和生長，進而促進其成血管分化[46]。

4.4 低氧對MSC成脂肪細胞分化的影響

低氧對MSC成脂肪細胞分化的影響目前尚無定論。何覓春在低氧對脂肪源性MSC生理特性影響的研究中發(fā)現，應用地塞米松在低氧條件下誘導MSC向脂肪細胞分化，培養(yǎng)14天后用油紅O染色，倒置顯微鏡下顯示低氧組染色較常氧組深，說明低氧可促進MSC成脂肪細胞分化[47]。Chen Jiang等在低氧條件下。HIF-1α和CCAAT/增強子組裝蛋白(C/EBPs)的轉錄促進BMSC成脂肪細胞分化的研究中發(fā)現，C/EBP家族在BMSC成脂肪細胞分化過程中起重要作用。在氧體積分數為0.2%的條件下培養(yǎng)BMSC，經Western blot檢測發(fā)現細胞中C/EBP家族中的C/EBPδ表達明顯上調，經免疫共沉淀檢測發(fā)現BMSC中脂肪細胞特異基因肥胖基因、脂蛋白脂肪酶(LPL)、饑餓誘導脂肪因子(PGAR)、低氧誘導蛋白2(HIG2)的表達增加，說明低氧可促進BMSC成脂肪細胞分化[48]。Sonia Prado Lopez等在低氧環(huán)境下培養(yǎng)MSC，并采用RT-PCR檢測MSC中前成脂肪細胞轉錄因子(C/EBPb)的表達水平，結果發(fā)現低氧條件下培養(yǎng)的MSC中C/EBPb表達增加，但當MSC在低氧條件下培養(yǎng)72 h后細胞中C/EBPb的表達消失。而在低氧條件下培養(yǎng)的MSC中與脂肪合成與分解相關的aP2基因的表達并無明顯變化，表明低氧對MSC的成脂肪細胞分化作用不大[29]。

綜上所述，在氧體積分數不低于1%的低氧環(huán)境下培養(yǎng)MSC可抑制其凋亡，促進其增殖，但這種促進作用可能具有一定的時間依賴性。當MSC生存環(huán)境的氧體積分數低于1%時可使其發(fā)生凋亡。局部的低氧環(huán)境對MSC遷移和多向分化能力的影響尚無統(tǒng)一看法，局部低氧對MSC多向分化能力的影響因其最終分化成的細胞的不同而不同。目前有研究表明局部的低氧環(huán)境可促進MSC遷移，促進其成血管、成骨或軟骨分化，但也有與之不同的研究結果。在今后的研究中若能明確低氧對MSC遷移、成血管、成骨或軟骨分化的影響及確切的機制，可能對MSC移植治療股骨頭壞死、大面積的軟骨損傷有一定的指導意義。

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10.13452/j.cnki.jqmc.2016.01.011

2015-11-12

朱雪玲(1992～)，女，漢族，天津籍，在讀碩士.#：通訊作者，suzhanhai@qhu.edu.cn