詹世淮 雷艷 黃梁滸 譚建明

三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞的研究進(jìn)展

詹世淮 雷艷 黃梁滸 譚建明

三維細(xì)胞培養(yǎng)是一種模擬細(xì)胞在體內(nèi)微環(huán)境生長(zhǎng)的新興培養(yǎng)技術(shù)。在三維支架中細(xì)胞能以三維空間的方式生長(zhǎng)，并以三維方式與周圍的微環(huán)境交互作用，能充分體現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的黏附、侵襲及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移過(guò)程，可作為動(dòng)物模型和二維培養(yǎng)模型之間的橋梁。三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)廣泛應(yīng)用于腫瘤模型構(gòu)建、腫瘤細(xì)胞生理學(xué)研究以及腫瘤耐藥機(jī)制分析等的研究。

三維； 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)； 腫瘤細(xì)胞； 藥物； 模型，結(jié)構(gòu)

二維（two dimensional，2D）單層細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)為細(xì)胞和分子生物學(xué)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。但是這種經(jīng)典的細(xì)胞體外培養(yǎng)模型與細(xì)胞真實(shí)的生長(zhǎng)環(huán)境和生長(zhǎng)方式還是有明顯的差異［1］。三維（three dimensional，3D）細(xì)胞培養(yǎng)模型作為一種新的細(xì)胞培養(yǎng)方式，它能更好的模擬細(xì)胞在人體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境［2］。

3D細(xì)胞培養(yǎng)這一概念于1968年最早提出［3］，現(xiàn)在3D培養(yǎng)技術(shù)已應(yīng)用于多種細(xì)胞系。3D細(xì)胞培養(yǎng)就是細(xì)胞以3D空間的方式在其中生長(zhǎng)，并以3D方式與周圍微環(huán)境中的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）、各種細(xì)胞因子、化學(xué)因子、物理機(jī)械力以及其它細(xì)胞發(fā)生交流與相互作用［4-5］。3D培養(yǎng)比2D培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)在于它拉近了細(xì)胞培養(yǎng)體系和細(xì)胞生理學(xué)之間的距離［6］。在2D模式下無(wú)法了解那些在體內(nèi)對(duì)細(xì)胞的分化、增殖和功能起重要作用的ECM成分，細(xì)胞與細(xì)胞的相互作用以及細(xì)胞與ECM的相互作用關(guān)系［7］。三維模型的建立拓展了細(xì)胞培養(yǎng)的研究領(lǐng)域。

一、構(gòu)建3D細(xì)胞生長(zhǎng)模型的支架

目前構(gòu)建3D細(xì)胞生長(zhǎng)模型的方法很多，如使用低附著力的細(xì)胞培養(yǎng)皿、軟瓊脂膠、具有生物活性的基質(zhì)膠、聚苯乙烯薄膜或人工設(shè)計(jì)的納米纖維支架等［8］。3D細(xì)胞培養(yǎng)依賴的組織工程研究支架材料主要包括以幾丁質(zhì)、膠原、透明質(zhì)酸類等ECM成分為代表的天然材料，以及聚酯類可降解聚合物（如聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸乙醇胺和聚乳酸/羥基乳酸共聚物）等合成材料［9］。動(dòng)物來(lái)源的天然生物材料，如膠原凝膠、糖胺聚糖具有與ECM相似的特性，能更好的模擬體細(xì)胞微環(huán)境，所構(gòu)建的工程化腫瘤組織與體內(nèi)腫瘤組織生物學(xué)特性相似，但往往有殘存的生長(zhǎng)因子、大量未鑒定的組分。組分明確的納米自組裝多肽支架材料彌補(bǔ)了這一缺點(diǎn)，如RGD多肽鏈交聯(lián)海藻酸鈉能提高支架材料的細(xì)胞黏附性能及生物活性［10］。

二、3D培養(yǎng)的腫瘤模型

（一）3D培養(yǎng)的腫瘤微環(huán)境

細(xì)胞周圍的環(huán)境在細(xì)胞分化的命運(yùn)與細(xì)胞功能方面起著關(guān)鍵作用。在進(jìn)化上非常保守的局部微環(huán)境提供了細(xì)胞生存的外部屏障，它包括化學(xué)（如活性氧族、缺氧、低pH）、物理（如基底膜、間充質(zhì)壓力、組織張力）和生物（如免疫監(jiān)視、抑制因子、ECM調(diào)節(jié)肽）等因素［11］。腫瘤微環(huán)境伴隨著許多情況，健康的微環(huán)境有助于塑造細(xì)胞行為。

當(dāng)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞培養(yǎng)在聚乳酸聚縮水甘油合成的支架材料中時(shí)，體內(nèi)外微環(huán)境發(fā)生了明顯改變。3D培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的分泌增加了2倍，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子分泌增加了23倍，白介素8（IL-8）分泌增加了23倍。而IL-8的表達(dá)只在3D培養(yǎng)中見(jiàn)到，2D培養(yǎng)中不見(jiàn)表達(dá)，證明IL-8在血管生成中具有重要的作用。這改變了人們之前的觀點(diǎn)，即2D培養(yǎng)中忽略了IL8在血管生成中的潛在作用［12］。

作者單位：350025 福州，福建省移植生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

（二）基于3D培養(yǎng)的腫瘤模型構(gòu)建

目前國(guó)內(nèi)外研究人員利用3D培養(yǎng)的組織工程技術(shù)，相繼在體外成功構(gòu)建了肝癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌和骨肉瘤等腫瘤體外研究模型。Lee等［13］以Matrigel 為支架材料，乳腺癌細(xì)胞系為種子細(xì)胞，體外構(gòu)建了組織工程化乳腺癌組織，并與構(gòu)建的正常乳腺組織相比較發(fā)現(xiàn)，正常乳腺細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞均能在3D立體生長(zhǎng)條件下保持各自的細(xì)胞特性，再造的組織工程化腫瘤組織能夠模擬腫瘤在體部分生物學(xué)行為。人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3細(xì)胞骨架戴在3D支架中間充質(zhì)特性的表達(dá)比上皮特性增加，再造的腫瘤樣組織在體內(nèi)具有較高成瘤性［14］。Wang 等［15］將人乳腺癌培養(yǎng)在多孔絲蛋白膠原支架上，研究乳腺癌細(xì)胞的侵襲與浸潤(rùn)，并探討了相關(guān)的分子機(jī)制。

（三）基于3D培養(yǎng)的腫瘤模型特點(diǎn)

在3D培養(yǎng)條件下腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)類似，都能形成中央壞死層，內(nèi)部休眠層和最外增殖層，特別是在腫瘤生長(zhǎng)的早期階段，在3D培養(yǎng)時(shí)能觀察到空心芯，這類似于體外腫瘤的壞死區(qū)。此外，3D培養(yǎng)條件下腫瘤細(xì)胞的增殖指數(shù)較低，2D單層培養(yǎng)和3D培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的代謝差異明顯不同［16］。當(dāng)用藥物作用于3D腫瘤球體和動(dòng)物模型時(shí)發(fā)現(xiàn)兩者反應(yīng)相似，這可能是因?yàn)樗麄兌际峭ㄟ^(guò)黏附和分泌可溶性因子增強(qiáng)細(xì)胞間的相互作用而導(dǎo)致pH降低和缺氧。3D腫瘤球體的耐藥性被認(rèn)為是類似于烷化劑作用于體內(nèi)腫瘤細(xì)胞。據(jù)觀察，在3D球體培養(yǎng)時(shí)小鼠乳腺癌細(xì)胞系耐各種烷化劑，但是在單層培養(yǎng)時(shí)并沒(méi)有表現(xiàn)出耐藥性。與單層培養(yǎng)相比，MCF-7和DLD-1細(xì)胞球體對(duì)抗癌藥物紫杉醇的IC50增加了100倍［17］。

三、3D培養(yǎng)研究腫瘤細(xì)胞

（一）腫瘤細(xì)胞生理學(xué)的應(yīng)用

3D細(xì)胞培養(yǎng)有助于更好地理解腫瘤細(xì)胞的各種功能，如細(xì)胞形態(tài)、增殖、黏附等。

1.腫瘤細(xì)胞形態(tài)與侵襲性：傳統(tǒng)2D單層和3D支架培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)明顯不同。乳腺癌細(xì)胞株2D培養(yǎng)時(shí)未表現(xiàn)出典型形態(tài)，但當(dāng)培養(yǎng)在lrECM 3D支架中時(shí)，能表現(xiàn)出圓形、塊狀、葡萄樣和星狀4種形態(tài)。MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞在Ⅰ型膠原水凝膠中培養(yǎng)3 d，細(xì)胞呈星狀，形態(tài)細(xì)長(zhǎng)并且核不規(guī)則，并能表現(xiàn)出腫瘤細(xì)胞的侵襲性增殖至整個(gè)水凝膠中形成細(xì)胞集落［18］。將腎腺癌細(xì)胞株Renca封裝在瓊脂糖支架中，與2D培養(yǎng)中的上皮樣形態(tài)明顯不同，3D培養(yǎng)條件下，細(xì)胞大而不規(guī)則具有較高的胞核比，或小而圓胞核比較低，這些細(xì)胞能形成活性更強(qiáng)、更大的腫瘤集落［19］。

2.腫瘤細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期：人宮頸癌上皮細(xì)胞培養(yǎng)在由聚苯胺的合成的納米3D支架中，與2D培養(yǎng)的細(xì)胞相比，更多細(xì)胞停滯在G0/G1期，處于S期細(xì)胞減少［20］。3D培養(yǎng)系統(tǒng)中細(xì)胞是非單層生長(zhǎng)，其能生存更長(zhǎng)時(shí)間且增殖率更慢。將TC-71尤文肉瘤細(xì)胞分別培養(yǎng)在2D單層和3D PCL支架中，發(fā)現(xiàn)在3D支架中，瘤細(xì)胞生長(zhǎng)明顯減慢［21］，該研究突出了3D培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，由于其減少孔隙和纖維直徑、表面積大，可用于精確評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖。

3.細(xì)胞黏附和信號(hào)傳導(dǎo)：多細(xì)胞生物體的細(xì)胞生長(zhǎng)在一個(gè)極其復(fù)雜的環(huán)境中，周圍有其他的細(xì)胞和結(jié)構(gòu)良好的基質(zhì)，與周圍細(xì)胞和基質(zhì)的信號(hào)傳導(dǎo)與黏附能控制細(xì)胞行為。2D與3D培養(yǎng)的細(xì)胞在信號(hào)傳導(dǎo)途徑方面顯著不同。

粘連蛋白是介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，遷移和黏附的多蛋白體。包括vinculin，talin，F(xiàn)AK等在內(nèi)的粘連蛋白，都存在于3D培養(yǎng)系統(tǒng)中，通過(guò)影響基質(zhì)變形而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖速度和活性。A549和ut-scc15細(xì)胞在3D培養(yǎng)體系、傳統(tǒng)的2D單層和層粘連蛋白豐富的ECM（lrECM）中培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)差異顯著，在這三種不同的培養(yǎng)體系中，前4天細(xì)胞群體的倍增時(shí)間相似。但對(duì)與細(xì)胞黏附，生物黏附，免疫反應(yīng)和組織發(fā)育相關(guān)的基因表達(dá)有差異［22］。

在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)方面，分別培養(yǎng)在2D與3D條件下，3D培養(yǎng)的尤文肉瘤細(xì)胞高表達(dá)細(xì)胞胰島素樣生長(zhǎng)因子受體Ⅰ（p-IGF-ⅠR），IGF-ⅠR/mTOR信號(hào)通路異常表達(dá)，而PIK3/Akt信號(hào)通路表達(dá)降低［23］，這與它們的遷移速度和增殖率降低的結(jié)果一致。

（二）腫瘤細(xì)胞對(duì)輻射敏感性的應(yīng)用

具有相同遺傳背景的2D生長(zhǎng)細(xì)胞與3D生長(zhǎng)細(xì)胞的輻射敏感性及DNA損傷修復(fù)能力不一樣。在接受同等計(jì)量的X射線輻照后，3D生長(zhǎng)的人肺癌細(xì)胞及人頭頸部鱗狀癌細(xì)胞與它們各自的2D生長(zhǎng)細(xì)胞相比，未修復(fù)的DNA雙鏈斷裂（DSB）位點(diǎn)比例降低，細(xì)胞存活率更高，表明3D培養(yǎng)細(xì)胞與2D培養(yǎng)細(xì)胞相比具有一定的輻射抗性［24］。但具體的機(jī)制尚不清楚，薛剛等［25］對(duì)表觀遺傳學(xué)調(diào)控介導(dǎo)2D與3D生長(zhǎng)癌細(xì)胞的輻射敏感性差異的研究正好解釋了A549細(xì)胞輻射抗性的原因。與2D培養(yǎng)的細(xì)胞相比，培養(yǎng)在Matrigel基質(zhì)膠中的A549細(xì)胞X射線輻射后miR-1915及DNA甲基化酶（DNMT1和DNMT3b）的表達(dá)量明顯下調(diào)，組蛋白乙?；窽ip60的表達(dá)量上調(diào)，具有重編程功能的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)顯著上調(diào)而使癌細(xì)胞獲得了干性，從而增加了對(duì)輻射的抗性。生長(zhǎng)環(huán)境的差異誘導(dǎo)2D與3D生長(zhǎng)細(xì)胞表觀遺傳改變，表觀遺傳調(diào)控上的差異導(dǎo)致2D與3D生長(zhǎng)癌細(xì)胞之間的DNA損傷修復(fù)差異，從而介導(dǎo)了他們之間的輻射敏感性差異。

（三）腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物耐藥性的應(yīng)用

2D藥物測(cè)試體系提供的信息有限，并往往具有誤導(dǎo)性，而動(dòng)物模型飽受倫理學(xué)的爭(zhēng)議，3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)有望作為二者的橋梁，在提高細(xì)胞的藥物篩選和識(shí)別毒性及鑒定無(wú)效的物質(zhì)成分方面具有更大的潛力。

藥物篩選研究需要一個(gè)真實(shí)的體外模型，可以有效地模仿腫瘤組織和幫助測(cè)量其體內(nèi)藥物反應(yīng)。而2D細(xì)胞培養(yǎng)缺乏這方面的要求?？谇击[狀癌細(xì)胞分別培養(yǎng)在3D 聚乳酸聚縮水甘油支架和2D條件下，并經(jīng)細(xì)胞毒性藥物PI3激酶抑制劑LY294002處理。2D培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞對(duì)LY294002很敏感，而在3D環(huán)境中表現(xiàn)出了明顯的藥物抵抗性［12］。將擁有相似遺傳圖譜的乳腺癌細(xì)胞系（AU565，SKBR3，hcc1569，和BT549）分別培養(yǎng)在傳統(tǒng)的2D單層和lrECM 3D基質(zhì)中，并分別給予曲妥單抗、帕妥珠單抗（單克隆抗體靶向HER2），拉帕替尼（HER2和EGFR雙重抑制劑），所有3D培養(yǎng)的細(xì)胞株都表現(xiàn)出了更強(qiáng)的藥物抵抗性，同時(shí)我們也觀察到在兩種培養(yǎng)條件下，每個(gè)細(xì)胞系對(duì)藥物的應(yīng)答反應(yīng)各不相同［26］。這表明，當(dāng)培養(yǎng)在lrECM 3D基質(zhì)中時(shí)，每個(gè)細(xì)胞系可能表現(xiàn)出不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。這樣的結(jié)果為我們提供了深入了解每個(gè)類型癌癥的具體要求，適用于特定的研究。

TC-71 EW腫瘤細(xì)胞分別培養(yǎng)在傳統(tǒng)2D單層和PCL 3D支架中時(shí)對(duì)阿霉素具有不同的應(yīng)答。培養(yǎng)在3D支架中的TC-71 EW腫瘤細(xì)胞對(duì)阿霉素有較強(qiáng)的抵抗性，其IC50為2.738mM，而培養(yǎng)在傳統(tǒng)2D單層中的TC-71 EW腫瘤細(xì)胞對(duì)阿霉素的抵抗性降低，其IC50為0.0122 mmol/L［20］?？够熕幬?，如順鉑、吉西他濱、5-FU、喜樹(shù)堿作用于培養(yǎng)在傳統(tǒng)2D和3D支架中的NSCLC細(xì)胞，研究結(jié)果表明，3D培養(yǎng)下的IC50值更高。抗腫瘤藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示，與3D培養(yǎng)相比，H1650 和H460細(xì)胞株在2D條件下凋亡的更多，且抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表達(dá)更少［27］。3D培養(yǎng)是一種更接近體內(nèi)的培養(yǎng)系統(tǒng)，它為藥物的開(kāi)發(fā)和試驗(yàn)提供了更好的平臺(tái)，他能更好的實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物安全性和風(fēng)險(xiǎn)性的評(píng)估。

四、結(jié)語(yǔ)與展望

傳統(tǒng)的2D培養(yǎng)技術(shù)在細(xì)胞與微環(huán)境的復(fù)雜交互作用方面存在諸多的局限性，隨著3D細(xì)胞培養(yǎng)的提出，更接近體內(nèi)真實(shí)的生長(zhǎng)環(huán)境，在許多方面體外研究更接近動(dòng)物模型。3D細(xì)胞培養(yǎng)可以更好地對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等進(jìn)行觀察，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)行研究，還可通過(guò)3D模型了解其對(duì)放化療的敏感性以及藥物的篩選。隨著3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，其在腫瘤藥物開(kāi)發(fā)，深入理解腫瘤細(xì)胞生理，基因和蛋白表達(dá)及癌癥研究方面具有廣泛的前景和重要的價(jià)值。

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（本文編輯：李少婷）

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A review of three dimensional cell culture systems for tumor cells

Zhan Shihuai， Lei Yan， Huang Lianghu， TanJianming.

Fujian Provincial Key Laboratory of Transplant Biology， Fuzhou General Hospital， Fuzhou 350025， China

Tan Jianming， Email： Tanjm156@xmu.edu.cn

3D cell culture is a new technology which can more accurately simulate the growth microenvironment of cells in vivo. Cells grown in three dimensional scaffolds interact with the surrounding microenvironment. 3D cell culture can fully reflect cell adhesion， invasion and metastasis， which is expected to bridge the gap between 2D culture and animal models. Here we review the current advances in cell physiology research， cancer drug resistance mechanism analysis and the construction of tumor model based on 3D cell culture.

Three-dimensional； Cell culture techniques； Cancer cell； Drug；Models，Structural

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.04.010

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81270431）

譚建明，Email：Tanjm156@xmu.edu.cn

（2016-05-23）