尤新國(guó) 樊姝彤 滿 怡 綜述 潘智芳 馮衛(wèi)國(guó) 審校

濰坊醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室（山東濰坊 261053）

·綜 述·

精子發(fā)生相關(guān)的鋅指蛋白的研究

尤新國(guó) 樊姝彤 滿 怡 綜述 潘智芳 馮衛(wèi)國(guó) 審校

濰坊醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室（山東濰坊 261053）

鋅指蛋白（zinc finger protein，ZNF）是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的具有“指狀”結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，可以與DNA、RNA、鋅指蛋白等結(jié)合，完成各項(xiàng)生物學(xué)功能，如細(xì)胞的增殖凋亡、胚胎的發(fā)育、腫瘤的發(fā)生與抑制等。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，部分鋅指蛋白參與精子的發(fā)生，并在精子生成的過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。本文對(duì)與精子發(fā)生相關(guān)的鋅指蛋白的背景知識(shí)及與精子發(fā)生的關(guān)系做簡(jiǎn)單闡述。

一、鋅指蛋白的概述

（一）鋅指蛋白的結(jié)構(gòu)及分類

1983年，Miller等首次在非洲爪蟾卵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子TFⅢA中發(fā)現(xiàn)了呈“手指”狀的鋅指蛋白[1]。隨后，上千種鋅指蛋白被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。鋅指蛋白是目前所知真核生物基因組中分布最廣的蛋白。1989年，Lee等通過(guò)磁共振的方法證實(shí)，每個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)都是由2個(gè)反向平行的β折疊片和1個(gè)α螺旋組成的獨(dú)立的包含Zn2+的小結(jié)構(gòu)域[2]，由組氨酸His和（或）多個(gè)半胱氨酸Cys通過(guò)Zn2+形成緊密的ββα四面體結(jié)構(gòu)。Zn2+穩(wěn)定了鋅指蛋白的螺旋構(gòu)象，是鋅指蛋白發(fā)揮調(diào)控功能的關(guān)鍵。

根據(jù)鋅指蛋白保守結(jié)構(gòu)域的特征，可以分為C2H2型、C4型、C6 型三類。其中 C4型又包括GATA蛋白，LIM蛋白和核激素受體蛋白[3]。

（二）鋅指蛋白的作用方式

鋅指蛋白具有可以識(shí)別DNA的結(jié)合域，是最大的 DNA 結(jié)合蛋白家族。通過(guò)自身的DNA結(jié)合域進(jìn)入DNA雙螺旋反應(yīng)溝內(nèi)，與DNA 堿基發(fā)生特異性結(jié)合，識(shí)別特定的DNA 序列[4]。其次，某些鋅指蛋白也可以結(jié)合RNA。Searles等第一次詳細(xì)研究了TFⅢA中的鋅指與5s RNA結(jié)合的特性[5]。同時(shí)，Mackay證明，鋅指蛋白與鋅指蛋白之間，也能夠通過(guò)相互作用調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄水平，完成相應(yīng)的生物學(xué)功能[6]。

二、鋅指蛋白與精子發(fā)生

精子發(fā)生是精原細(xì)胞經(jīng)過(guò)分裂分化發(fā)育為精子的過(guò)程，包括生殖細(xì)胞發(fā)育為精原細(xì)胞，精原細(xì)胞增殖再發(fā)育為精母細(xì)胞，精母細(xì)胞減數(shù)分裂形成圓形精子，圓形精子變形為精子等階段。該過(guò)程涉及眾多基因和蛋白的調(diào)控[7,8]。

（一）鋅指蛋白313

ZNF313基因定位于20q13，編碼288個(gè)氨基酸，屬于C2H2類鋅指蛋白[9]。ZNF313基因具有2個(gè)轉(zhuǎn)錄本，較短的為753bp，較長(zhǎng)的為24Kb，兩者開(kāi)放閱讀框架完全一致。較短的轉(zhuǎn)錄本在睪丸組織中高表達(dá)[10]。RT-PCR分析顯示，與正常男性睪丸比較，ZNF313基因在無(wú)精子癥患者及胎兒睪丸中的表達(dá)明顯降低；通過(guò)免疫組化檢測(cè)及亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，ZNF313定位于精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞和次級(jí)精母細(xì)胞的細(xì)胞核中。該基因主要是核蛋白，可能參與了睪丸組織的發(fā)育過(guò)程并調(diào)控精子發(fā)生，主要在精原細(xì)胞增殖，精母細(xì)胞減數(shù)分裂形成圓形精子的過(guò)程中發(fā)揮作用。

ZNF313同時(shí)含有C3HC4的RNIG鋅指結(jié)構(gòu)域和C2H2的鋅指結(jié)構(gòu)域[9]。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)[11,12]：不同生物ZNF313的兩種鋅指結(jié)構(gòu)域及其周?chē)陌被嵝蛄芯直Ｊ?。預(yù)測(cè)這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域在ZNF313功能研究方面發(fā)揮重大作用。ZNF313的RING鋅指結(jié)構(gòu)域有兩個(gè)β折疊片（β1和β2），一個(gè)α螺旋。C2H2鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)域有一個(gè)較長(zhǎng)的α螺旋。這個(gè)區(qū)域與泛素結(jié)構(gòu)域（UIM domain）有一定的同源性[11]。推測(cè)ZNF313蛋白對(duì)精子生成過(guò)程的調(diào)控是通過(guò)泛素途徑實(shí)現(xiàn)的。

Proscan軟件分析發(fā)現(xiàn)，ZNF313基因缺乏TATAbox和CAATbox啟動(dòng)子序列，但檢測(cè)到 AP-2、T-Ag 和 SP-1結(jié)合位點(diǎn)等保守序列[13]。 轉(zhuǎn)錄因子特化蛋白-1（SP-1）結(jié)合于保守性序列GGGCGG的GC豐富序列，并發(fā)揮重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[14]。研究發(fā)現(xiàn)，SP-1可在多種組織中表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)。深入探究SP-1在ZNF313基因的表達(dá)調(diào)控中所起的重要作用，將有助于分析ZNF313基因在生精過(guò)程中的具體作用，為無(wú)精子癥疾病的治療提供好的解決方案。

（二）鋅指蛋白265

ZNF265首先由Karginova等[15-17]在大鼠腎球旁細(xì)胞中克隆，具有兩個(gè)C4型鋅指蛋白，一個(gè)Ser-Are（SR）富集區(qū)，一個(gè)谷氨酸富集區(qū)，一個(gè)核定位信號(hào)（NLS）。ZNF265在組織中普遍表達(dá)，具有典型的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，可以推測(cè)ZNF265通過(guò)與目的基因的mRNA結(jié)合調(diào)控目的基因，在基因調(diào)控，細(xì)胞分化，個(gè)體發(fā)育、疾病發(fā)生等方面發(fā)揮重要作用。

ZNF265在大鼠睪丸組織中的表達(dá)具有特異性，主要表達(dá)在睪丸支持細(xì)胞細(xì)胞核核周胞質(zhì)，精子的尾部前端、血-睪屏障、血-附睪屏障。目前ZNF265與精子發(fā)生相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究重點(diǎn)集中在其表達(dá)對(duì)睪丸支持細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制[18]。研究已證實(shí)，支持細(xì)胞通過(guò)分泌TGF-β1、表達(dá)FasL，抑制炎癥因子IL-lα和IL-6 的表達(dá)，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[19]。干擾ZNF265表達(dá)后，IL-lα和 IL-6 的表達(dá)升高。而炎癥晚期高表達(dá)的ZNF265則下調(diào)了炎癥因子的表達(dá)，推斷ZNF265作為調(diào)控因子，可能通過(guò)作用于TGF-β1在支持細(xì)胞炎癥反應(yīng)中發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用。明確ZNF265在支持細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制，對(duì)于深入研究精子發(fā)生的調(diào)節(jié)等過(guò)程具有重要意義。

（三） 鋅指蛋白185

1997年，Heiss等[20]通過(guò)外顯子捕獲的方法獲得ZNF185。該基因定位于X 染色體長(zhǎng)臂2區(qū)8帶（Xq28）DXS52 區(qū)域。ZNF185cDNA編碼一個(gè)452個(gè)氨基酸的蛋白，其鋅指結(jié)構(gòu)中富含Cys，結(jié)構(gòu)單體為Cys2HisCys5，C端有一個(gè)LIM（Lin-1,Isl-1 and Mc-e 3）結(jié)構(gòu)域，是LIM型鋅指蛋白。LIM結(jié)構(gòu)域和多種蛋白質(zhì)，如蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子等發(fā)生相互作用，調(diào)控某些基因的表達(dá)、細(xì)胞分化和細(xì)胞骨架形成等過(guò)程[21]。ZNF185在前列腺、骨髓、外周血、腦、肺、腎等組織也有較高表達(dá)[22]。

提取小鼠肝、睪丸與卵巢組織進(jìn)行Westernbloting及免疫熒光技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，睪丸組織中ZNF185含量最多，在睪丸支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和成熟精子中都有表達(dá)，成熟精子中表達(dá)量最高[23,24]，明確了ZNF185在生殖細(xì)胞中的定位。支持細(xì)胞的主要作用是為各級(jí)生精細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)支持，形成血-睪屏障，提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，調(diào)節(jié)精子發(fā)生等。間質(zhì)細(xì)胞的主要作用是合成并分泌雄性激素（主要是睪酮），ZNF185在小鼠支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)高表達(dá)，推測(cè)ZNF185與精子發(fā)生過(guò)程中免疫屏障結(jié)構(gòu)的形成及雄性激素的合成、分泌及運(yùn)輸相關(guān)[25-28]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，ZNF185在性成熟前小鼠睪丸中的表達(dá)低于性成熟組和老年組，在精原細(xì)胞和精母細(xì)胞中無(wú)表達(dá)，精子中高表達(dá)。提示ZNF185在精子發(fā)生過(guò)程中主要作用于精子形成及釋放過(guò)程。有研究報(bào)道表明，ZNF185參與了肌動(dòng)蛋白（actin）共定位[29]。2012年鄭全輝等證明ZNF185 與細(xì)胞骨架的結(jié)合是其發(fā)揮抑癌作用的關(guān)鍵，ZNF185通過(guò)與肌動(dòng)蛋白纖維的結(jié)合，抑制人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移[30,31]。而精子發(fā)生包括有絲分裂期，減數(shù)分裂期和精子形成期，該過(guò)程涉及細(xì)胞的分裂，運(yùn)動(dòng)等生理過(guò)程，需要大量細(xì)胞骨架的參與。推測(cè)ZNF185和精子發(fā)生密切相關(guān)，其發(fā)生機(jī)制與細(xì)胞骨架相關(guān)。分析其表達(dá)調(diào)控機(jī)制可以豐富精子發(fā)生的分子機(jī)理，為避孕藥的研發(fā)提供可靠的分子靶點(diǎn)，具有重要的臨床意義。

三、結(jié)語(yǔ)

雖然人類輔助生殖技術(shù)發(fā)展迅速，但對(duì)于導(dǎo)致男性不育的關(guān)鍵基因及作用機(jī)制知之甚少。發(fā)現(xiàn)并確定這些基因的作用機(jī)制才能為臨床治療提供理論支持，從根本上解決問(wèn)題。鋅指蛋白基因家族作為哺乳動(dòng)物最大的基因家族之一，近年來(lái)在癌癥的發(fā)生，機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)控等方面具有重要的研究前景。隨著研究的進(jìn)行，鋅指蛋白在精子發(fā)生過(guò)程中的作用日益受到重視。以上概述了與精子發(fā)生相關(guān)的部分鋅指蛋白的知識(shí)背景和研究進(jìn)展，為研究生精過(guò)程的作用機(jī)制提供了部分理論依據(jù)。鋅指蛋白具有的生物學(xué)功能是廣泛多樣的，如ZNF185不僅影響精子發(fā)生，同時(shí)在腫瘤發(fā)生和細(xì)胞骨架方面也起了至關(guān)重要的作用等。這啟發(fā)我們，研究鋅指蛋白和精子發(fā)生的作用機(jī)制，可以通過(guò)這些蛋白在其他領(lǐng)域的生物功能，進(jìn)行推測(cè)分析。

近年來(lái)，隨著對(duì)鋅指蛋白作用方式的分析研究，根據(jù)人類需要，設(shè)計(jì)相應(yīng)功能的人工鋅指蛋白調(diào)控目的基因等技術(shù)有了很大發(fā)展，因此對(duì)鋅指蛋白功能的研究尤為重要。目前所了解的鋅指蛋白在精子發(fā)生方面的研究尚處于起步階段，其具體的生殖調(diào)控機(jī)制尚待探討和完善。相信隨著進(jìn)一步的研究，更多與精子發(fā)生相關(guān)的鋅指蛋白被發(fā)現(xiàn)。可以確定，鋅指蛋白的研究與應(yīng)用，在精子發(fā)生方面有重大的前景，對(duì)男性不育等問(wèn)題具有重要的理論和臨床意義。

致謝：本課題受山東省科技發(fā)展計(jì)劃（2 0 1 5 G S F 1 1 8 1 7 8）；山東省自然科學(xué)基金（ZR2013CM032）；山東省衛(wèi)計(jì)委科技項(xiàng)目（201411）；濰坊醫(yī)學(xué)院科技創(chuàng)新基金（K1302001）資助

鋅指蛋白; 精子發(fā)生; 基因

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（2016-08-30收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.10.016

R 321.1; R 349.64