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(1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院2012級(jí)檢驗(yàn)專業(yè)本科生，湖南 長(zhǎng)沙 410078；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系)

·文獻(xiàn)綜述·

循環(huán)microRNAs與缺血性腦卒中的研究進(jìn)展

鄭昭烽1，羅秀菊2*

(1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院2012級(jí)檢驗(yàn)專業(yè)本科生，湖南 長(zhǎng)沙 410078；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系)

MicroRNAs(miRNAs)是一類真核生物中廣泛存在的小分子單鏈非編碼RNA，通過與靶mRNA特異性結(jié)合，降解靶基因mRNA或抑制其翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平特異性地調(diào)控靶基因的表達(dá)。miRNAs不僅調(diào)節(jié)與機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，還參與疾病的發(fā)生發(fā)展過程。循環(huán)miRNAs是指血液中游離的miRNAs，有望成為某些疾病(如缺血性腦卒中)的生物標(biāo)志物。本文將對(duì)miRNAs的生物學(xué)特性、檢測(cè)方法及循環(huán)miRNAs與缺血性腦卒中的關(guān)系做一綜述。

循環(huán)MicroRNAs； 缺血性腦卒中； 診斷； 生物標(biāo)志物

非編碼RNA是當(dāng)前生命科學(xué)研究的前沿?zé)狳c(diǎn)之一，其中，microRNAs(miRNAs)是一類長(zhǎng)為20～24核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNAs，通過與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′ UTRs)互補(bǔ)配對(duì)，降解靶基因mRNA或抑制其翻譯，在調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育和分化、增殖與凋亡等方面發(fā)揮重要作用[1]。miRNAs廣泛存在于各種生物體內(nèi)，包括線蟲、果蠅、家鼠、植物和人體內(nèi)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，不同的疾病狀態(tài)下(如腫瘤、糖尿病、心血管疾病和中風(fēng)等[3-5])，一些miRNAs的表達(dá)水平可出現(xiàn)特征性的變化(如升高或者降低)，通過對(duì)miRNAs表達(dá)譜的檢測(cè)有助于疾病的診斷。循環(huán)miRNAs指血液中游離的miRNAs，具有穩(wěn)定性高等特點(diǎn)。血漿或血清中循環(huán)miRNAs檢測(cè)具有創(chuàng)傷小、靈敏度高、樣本收集程序簡(jiǎn)便、一個(gè)樣本可同時(shí)檢測(cè)多項(xiàng)參數(shù)等優(yōu)點(diǎn)，有望成為一種新型的生物標(biāo)志物。缺血性腦卒中是腦血流供應(yīng)障礙所致的腦部病變，是世界范圍內(nèi)的重大公共衛(wèi)生問題，已經(jīng)成為全球第二大致死原因和致殘的首要原因[6]。近年發(fā)現(xiàn)miRNAs與缺血性腦卒中密切相關(guān)，本文主要對(duì)miRNAs的生物學(xué)特性、檢測(cè)方法及循環(huán)miRNAs與缺血性腦卒中的關(guān)系做一綜述。

1 miRNAs

最早被人類所認(rèn)識(shí)的miRNAs是lin-4和它的靶mRNA，lin-14。1993年，Lee等人[7]通過遺傳學(xué)方法在線蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了這種小分子RNA-lin-4。Lin-4并不編碼蛋白質(zhì)，而是通過與lin-14 mRNA的3′非翻譯端(UTR)特異性結(jié)合，抑制lin-14 mRNA的表達(dá)，從而減少lin-14蛋白水平。2000年，Reinhart[8]等人在秀麗桿狀線蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了具有時(shí)序調(diào)控功能的小分子非編碼RNA-let-7，let-7長(zhǎng)為21 nt，也是第二個(gè)被發(fā)現(xiàn)的miRNAs。很快在其他兩側(cè)對(duì)稱動(dòng)物包括哺乳動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)了let-7的同系物，其與線蟲體內(nèi)let-7的表達(dá)類似，表明miRNAs可能是一類保守且具有基因調(diào)控功能的小分子物質(zhì)[9]。許多實(shí)驗(yàn)室陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了更多的miRNAs。目前普遍認(rèn)為，在動(dòng)物體內(nèi)，miRNAs基因在細(xì)胞核內(nèi)由RNA聚合酶II(polII)轉(zhuǎn)錄為具有帽子結(jié)構(gòu)(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾(AAAAA)的pri-miRNAs。pri-miRNAs在核酸酶Drosha和其輔助因子Pasha的作用下被剪切成70～100個(gè)核苷酸大小的具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的pre-miRNAs，再由RNA-GTP和exportin 5將pre-miRNAs輸送到胞質(zhì)中。Pre-miRNAs在核酸酶Dicer作用下，剪切為成熟的miRNAs。后者被引導(dǎo)進(jìn)入沉默復(fù)合體(RISC)復(fù)合體中，與靶mRNA通過堿基配對(duì)結(jié)合，引起靶mRNA的降解或轉(zhuǎn)錄后的翻譯抑制[2]。推測(cè)，miRNAs調(diào)控著超過1/3的人類基因的表達(dá)[2]。miRNAs在各個(gè)物種間保持高度保守性,且具有一定的組織特異性。在不同組織中，miRNAs的分布與表達(dá)存在差異。如miR-122在肝臟中高度表達(dá)，而在其他器官組織中表達(dá)很低[10]。

miRNAs可在外周血中穩(wěn)定存在，能抵抗核糖核酸酶(RNase A)的消化作用。2008年，Lawrie[11]等人發(fā)現(xiàn)miR-21可以在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者的血液中穩(wěn)定存在，miR-21成為第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的循環(huán)miRNAs。循環(huán)miRNAs來源于正常的外周血細(xì)胞或患病的組織細(xì)胞，如腫瘤、炎癥等[12]。組織中miRNAs進(jìn)入血液循環(huán)的方式至少包括被動(dòng)釋放和主動(dòng)分泌，以主動(dòng)分泌為主。當(dāng)組織損傷時(shí)，miRNAs從凋亡或破碎細(xì)胞中被動(dòng)釋放。主動(dòng)分泌具有兩種形式，即直接分泌游離的miRNAs或通過囊泡的形式分泌到胞外[13]。血液中miRNAs通常與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，無論在室溫條件下操作還是反復(fù)凍融都很穩(wěn)定。在特定疾病中血液中miRNAs的表達(dá)譜會(huì)發(fā)生變化,因此，循環(huán)miRNAs有望成為具有廣大前景的疾病診斷與預(yù)后的分子標(biāo)志物，如在結(jié)腸癌患者中[14]，血漿miR-21、miR-135b和miR-141顯著升高，可作為結(jié)腸癌篩查的分子標(biāo)志物，而循環(huán)miR-155則具有早期診斷食道癌的作用[15]。

2 循環(huán)MicroRNA的檢測(cè)方法

目前有多種方法可以檢測(cè)和鑒定miRNAs，如，Northern blot、DNA微陣列芯片、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)等。Northern blot是檢測(cè)miRNAs表達(dá)的經(jīng)典方法[16],其基本原理是通過電泳將miRNAs分開，再轉(zhuǎn)移到膜上，與特定基因互補(bǔ)片段的探針雜交后顯影即可完成對(duì)miRNAs的檢測(cè)。Northern blot可以同時(shí)測(cè)定miRNAs的相對(duì)分子質(zhì)量和豐度，具有較高的特異性。該方法操作繁瑣、費(fèi)時(shí)且靈敏度低，其應(yīng)用受到限制，一般不適用于臨床的大規(guī)模篩查。DNA微陣列芯片(基因芯片)，能一次反映上千個(gè)基因的表達(dá)變化，是一種高通量的檢測(cè)方法,可與Northern blot聯(lián)合使用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)是檢測(cè)miRNAs的最常用的方法，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析[17]。

3 循環(huán)miRNAs與缺血性腦卒中

缺血性腦卒中是由于各種原因引起的腦部血液供應(yīng)障礙，使局部腦組織發(fā)生不可逆性損害，導(dǎo)致腦組織缺血、缺氧性壞死，而出現(xiàn)相應(yīng)神經(jīng)功能缺損的一類臨床綜合征。具有高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率等特點(diǎn)。早期準(zhǔn)確診斷缺血性腦卒中，及時(shí)給予抗凝、溶栓等治療，對(duì)減少缺血性腦卒中的致死致殘率意義重大。目前對(duì)缺血性腦卒中的診斷主要依賴患者臨床表現(xiàn)和影像學(xué)檢查，不僅需昂貴的設(shè)備，而且往往會(huì)錯(cuò)過最佳診治時(shí)機(jī)。近來研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs參與了缺血性腦卒中發(fā)生發(fā)展的病理過程，包括動(dòng)脈粥樣硬化、腦水腫、缺血—再灌注損傷及腦梗死后血管新生等[18-19]。因此，循環(huán)miRNAs檢測(cè)有望為急性缺血性卒中的早期診斷、治療干預(yù)提供新的思路和潛在的治療靶點(diǎn)。

大鼠腦缺血—再灌注損傷模型中，缺血后再灌注24 h后，大鼠血漿中miR-19b、-290、-292-5p水平升高，而miR-103水平則明顯降低，提示這些miRNAs可能與腦缺血損傷相關(guān);再灌注48 h后，血漿及腦組織中出現(xiàn)新的miRNAs變化，可能反映了腦損傷的恢復(fù)修復(fù)狀況[20]。研究顯示，再灌注24 h和48 h后，有10種miRNAs在血漿和腦組織中的變化水平趨于一致，如miR-290、let-7i等。已知腦組織中存在多種特異表達(dá)的miRNAs，檢測(cè)血漿中腦特異性miRNAs對(duì)缺血性腦卒中的診斷意義更大。在大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞模型(MCAO)中，血漿腦特異性miR-124在缺血6h后即開始升高，一直持續(xù)到48 h[21]。miR-124參與了神經(jīng)元分化、神經(jīng)生長(zhǎng)發(fā)育以及腦組織損傷后的調(diào)控[22-23],因此，血漿中miR-124水平升高與腦損傷修復(fù)密切相關(guān)。我們最近研究發(fā)現(xiàn),MCAO大鼠血漿miR-107水平顯著上升，與血漿谷氨酸水平呈正相，進(jìn)一步證實(shí)血漿中某些miRNAs可能是缺血性腦卒中潛在的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[24]。

雖然已知眾多miRNAs(如miR-124、miR-107)可能參與了缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展，但能否通過監(jiān)測(cè)外周血miRNAs水平變化反映缺血性腦損傷情況是臨床上普遍關(guān)心的問題。Gan[25]等人發(fā)現(xiàn)循環(huán)miR-145水平在缺血性腦卒中患者中明顯升高；利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)缺血性腦卒中患者外周血腦特異性的miR-107、miR-128b、miR-137和miR-153的水平，發(fā)現(xiàn)miR-107、miR-128b和miR-153表達(dá)上調(diào)，提示其有可能成為缺血性腦卒中診斷的潛在生物標(biāo)志物[24,26]。Tan,等[27]用基因芯片檢測(cè)青年缺血性腦卒中患者血液中836種miRNAs，發(fā)現(xiàn)157種miRNAs在腦卒中患者中的表達(dá)發(fā)生改變，其中17種miRNAs(如hsa-let-7e、miR-1184、-1246、-1261、-1275、-1285、-1290、-181a、-25*、-513a-5p、-550、-602、-665、-891a、-993、-939、-923)在各個(gè)亞型中均高表達(dá),比如大血管動(dòng)脈硬化型(LA)、小血管疾病型(SA)、心源性栓塞型(CEmb)及病因未明型腦缺血(UND)，而8種miRNAs(hsa-let-7f、miR-126、-1259、-142-3p、-15b、-186、-519e、-768-5p)在LA、SA和CEmb組中表達(dá)明顯下調(diào)。生物信息學(xué)分析表明這些變化的miRNA可參與細(xì)胞增殖、止血、氧化應(yīng)激和炎癥等過程[28,29]，合并所有亞型分析顯示，miRNAs下調(diào)數(shù)目較多的腦卒中患者預(yù)后相對(duì)較好。龍光文,等[30]的研究發(fā)現(xiàn)miR-30a、miR-126和let-7b(let-7b-LA)在缺血性腦卒中患者中表達(dá)顯著下調(diào)，而Let-7b(let-7b-SA、let-7b-CEmb和let-7b-UDN)表達(dá)上調(diào),miR-30a、miR-126和let-7b在診斷缺血性腦卒中具有很高的特異性和敏感性。以上的研究提示，腦卒中后miRNAs表達(dá)譜的改變，可為腦卒中病因鑒別及預(yù)后判斷提供依據(jù)。此外，缺血性腦卒中患者miRNAs存在多態(tài)性的改變。Jeon等[31]對(duì)678例腦卒中患者miRNAs多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)miR-146a C>G位點(diǎn)多態(tài)性和miR-146aG/-149T/-196a2C/-499G等位基因組合與腦卒中發(fā)生密切相關(guān)，且miR-146a C>G位點(diǎn)多態(tài)性增加血壓正常的非糖尿病女性人群腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)。

4 結(jié) 語(yǔ)

雖然目前很多研究表明循環(huán)miRNAs表達(dá)水平異常與缺血性腦卒中相關(guān)，但二者之間的因果關(guān)系仍不清楚。目前尚未有直接證據(jù)表明循環(huán)miRNAs表達(dá)異常是缺血性腦卒中導(dǎo)致的結(jié)果，其中的機(jī)制還待進(jìn)一步探究。隨著循環(huán)miRNAs檢測(cè)方法的完善，循環(huán)miRNAs生物學(xué)特征、作用機(jī)制以及與缺血性腦卒中的關(guān)系的進(jìn)一步闡明，在不久的將來，循環(huán)miRNAs有望應(yīng)用于臨床實(shí)踐，為缺血性腦卒中早期診斷并其預(yù)后判斷發(fā)揮巨大的價(jià)值。

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10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.03.032

2016-03-12；

2016-04-22

國(guó)家自然科學(xué)基金 (81573430)，湖南省自然科學(xué)基金(2015JJ2156)資助.

*通訊作者，E-mail:xjluo22@csu.edu.cn.

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秦旭平)