燕鳳　陳必良　徐慧　李春燕　徐盈　王德堂　郭芬芬　黎昱　鄭嬌　張建芳

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科產(chǎn)前會(huì)診中心，陜西 西安　710032)

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無(wú)創(chuàng)DNA陽(yáng)性結(jié)果的驗(yàn)證和分析

燕鳳陳必良徐慧李春燕徐盈王德堂郭芬芬黎昱鄭嬌張建芳

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科產(chǎn)前會(huì)診中心，陜西 西安710032)

目的探討無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用及價(jià)值。方法對(duì)2012年1月至2014年12月在西京醫(yī)院婦產(chǎn)科做羊水穿刺的病人資料回顧性分析，發(fā)現(xiàn)因無(wú)創(chuàng)陽(yáng)性做羊水穿刺的孕婦84例，用羊水染色體核型分析和FISH對(duì)其結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，并對(duì)兩者不一致的結(jié)果進(jìn)行電話隨訪。結(jié)果無(wú)創(chuàng)DNA84例陽(yáng)性結(jié)果中21-三體48例，經(jīng)羊水穿刺后確認(rèn)為假陽(yáng)性的有2例；18-三體11例，經(jīng)羊水穿刺后確認(rèn)為假陽(yáng)性3例；13-三體4例，經(jīng)羊水穿刺驗(yàn)證2例為假陽(yáng)性；性染色體異常21例，經(jīng)驗(yàn)證6例假陽(yáng)性。結(jié)論孕婦外周血中游離胎兒DNA檢測(cè)對(duì)21-三體檢測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)95.8%，18-三體準(zhǔn)確率73%，性染色體檢出準(zhǔn)確率71%，13-三體準(zhǔn)確率50%。無(wú)創(chuàng)DNA是產(chǎn)前篩查21-三體的有效方法，對(duì)其他染色體異常的檢測(cè)還需要進(jìn)一步提高現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)。

無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)； 異常結(jié)果； 核型分析；FISH

染色體非整倍體是指相對(duì)于人正常的46條染色體細(xì)胞中的一條或幾條染色體數(shù)目增加或減少。目前，我國(guó)新生兒中染色體的發(fā)病率為1/60，其中21-三體、18-三體和13-三體是3種最主要的染色體非整倍體疾病。目前臨床上對(duì)胎兒這幾種病變產(chǎn)前診斷方法主要是通過B超引導(dǎo)下的羊水穿刺染色體核型分析，該技術(shù)檢測(cè)所需時(shí)間長(zhǎng)，穿刺過程又對(duì)胎兒有一定的風(fēng)險(xiǎn)。因此，尋求安全、準(zhǔn)確、快速的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)是優(yōu)生優(yōu)育的基本需要。而胎兒染色體非整倍體的無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)通過采取孕婦靜脈血，利用新一代DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)母體外周血漿中的游離DNA 片段(包含胎兒游離DNA)進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息分析，可以從中得到胎兒的遺傳信息[1]。本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)孕婦外周血中的游離DNA，對(duì)其異常結(jié)果進(jìn)行分析驗(yàn)證，旨在探討無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1　材料與方法

1.1基本資料2012年1月至2014年12月在西京醫(yī)院婦產(chǎn)科產(chǎn)前診斷中心因無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)結(jié)果高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦84例，自愿做羊水穿刺。使用染色體FISH和核型分析對(duì)無(wú)創(chuàng)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證并對(duì)每個(gè)孕婦的妊娠結(jié)局的進(jìn)行隨訪。

1.2方法

1.2.1染色體制備B超引導(dǎo)定位，在無(wú)菌條件下，采用羊水專用穿刺針經(jīng)腹部穿刺，抽取15 ml 羊水，經(jīng)離心處理后接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為CHANG MEDIUM。經(jīng)過換液后觀察，鏡下見小堆貼壁細(xì)胞長(zhǎng)成大的克隆，并出現(xiàn)成對(duì)圓形透亮細(xì)胞，即可加入秋水仙堿收獲細(xì)胞，經(jīng)低滲、數(shù)次固定后常規(guī)制片，60～80℃烤片2小時(shí)。G顯帶染色分析。

1.2.2FISH檢測(cè)未培養(yǎng)的羊水參照金菩嘉公司提供的操作步驟處理后進(jìn)行FISH分析。每個(gè)雜交區(qū)至少數(shù)100個(gè)信號(hào)強(qiáng)、無(wú)重疊的雜交細(xì)胞。CSP18/X/Y探針和GLP13/21探針。陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：GLP13/21、CSP18/X/Y探針至少計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，非整倍體細(xì)胞比例>60%判為非整倍體。非整倍體細(xì)胞比例>30%為嵌合體。

1.2.3追蹤隨訪對(duì)因無(wú)創(chuàng)陽(yáng)性做羊水穿刺確診的孕婦進(jìn)行電話隨訪，隨訪其妊娠結(jié)局或出生后孩子的性別及出生后的健康狀況。

2　結(jié)果

無(wú)創(chuàng)DNA84例陽(yáng)性結(jié)果中，21-三體48例，18-三體11例，13-三體4例，性染色體異常21例。無(wú)創(chuàng)84例陽(yáng)性結(jié)果無(wú)創(chuàng)提示48例21-三體經(jīng)羊水染色體核型和FISH驗(yàn)證16例為21-三體，2例假陽(yáng)性，假陽(yáng)性率為4.2%。無(wú)創(chuàng)DNA檢出18-三體11例經(jīng)驗(yàn)證，3例假陽(yáng)性，假陽(yáng)性率為27%；無(wú)創(chuàng)13-三體高風(fēng)險(xiǎn)有4例經(jīng)驗(yàn)證2例為假陽(yáng)性，假陽(yáng)性率為50%；無(wú)創(chuàng)DNA提示性染色體異常21例，經(jīng)核型和FISH驗(yàn)證6例為假陽(yáng)性，假陽(yáng)性率為29%。

84例無(wú)創(chuàng)DNA結(jié)果異常的孕婦均對(duì)其進(jìn)行了電話隨訪，其中染色體異常結(jié)果共71例引產(chǎn)70例，其中1例胎兒核型47,XXY，孕婦不想引產(chǎn)。因孕婦已發(fā)生3次胚胎停育此次自愿繼續(xù)妊娠。其中13例無(wú)創(chuàng)DNA假陽(yáng)性結(jié)果經(jīng)染色體核型和FISH確認(rèn)染色體核型正常的出生后電話隨訪后，家屬均口述發(fā)育正常，健康，隨訪發(fā)現(xiàn)性別與染色體結(jié)果均一致。

3　討論

在孕婦妊娠期開辟一種安全、可靠的產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷方法進(jìn)行產(chǎn)前干預(yù)，是當(dāng)前降低出生缺陷率最切實(shí)可行的方法。目前侵入式取樣是產(chǎn)前診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但其存在一定的弊端[2]。因此針對(duì)妊娠高危人群進(jìn)行多技術(shù)聯(lián)合篩查和診斷，并根據(jù)病人自身情況作出合適的選擇。胎兒染色體非整倍體無(wú)創(chuàng)基因檢測(cè)技術(shù)它具有無(wú)創(chuàng)性、孕早期檢測(cè)、相對(duì)血清學(xué)檢查有很高的準(zhǔn)確性。早孕期檢測(cè)最主要的優(yōu)勢(shì)是早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早干預(yù)，早期終止妊娠相對(duì)于中期引產(chǎn)更安全，還可以減少孕婦及家屬的焦慮。但胎兒染色體非整倍體無(wú)創(chuàng)基因檢測(cè)技術(shù)也有一定的局限性。首先該技術(shù)對(duì)目前檢測(cè)的對(duì)象具有局限性，如母體本身染色體有異常( 如嵌合體， 21-三體平衡易位攜帶)，或者母體在孕前期接受異體輸血、移植手術(shù)、干細(xì)胞治療等，均對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性造成影響。并且孕婦孕周較大接受胎兒染色體非整倍體無(wú)創(chuàng)基因檢測(cè)，檢測(cè)的結(jié)果為陽(yáng)性的，再接受羊水穿刺手術(shù)檢查胎兒染色體，不僅增加病人的焦慮感，而且手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)也相對(duì)增加。因此不建議孕周超過24周的孕婦做無(wú)創(chuàng)基因檢測(cè)。同時(shí)對(duì)于B超篩查如心腦血管系統(tǒng)異常，羊水量異常，明顯器官、四肢異常及NT值異常的都不建議做無(wú)創(chuàng)基因檢測(cè)。同時(shí)，雙胎或多胎也不適合做無(wú)創(chuàng)基因檢測(cè)。

影響無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的主要因素是孕婦外周血中胎兒游離DNA濃度。如果胎兒游離DNA濃度低于3%，檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性將受到一定的影響[3,4]。研究表明，孕婦血清中游離DNA的含量受孕周和體重的影響。一般認(rèn)為孕8周后孕婦外周血中游離胎兒DNA含量上升并穩(wěn)定存在，孕期胎兒DNA含量在5%～50%，孕周越大DNA含量越高。無(wú)創(chuàng)DNA要求孕婦血清中游離DNA的含量占外周血中總DNA的50%以上，所以當(dāng)孕婦由于各種原因?qū)е伦陨碛坞xDNA含量增高時(shí)孕婦血中胎兒游離DNA含量就相對(duì)偏低，這時(shí)就會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)失敗。臨床上引起孕婦自身DNA增高的原因有溶血、腫瘤等，另外也可能與個(gè)體差異有關(guān)。如孕婦自身體重指數(shù)肥胖，將增加循環(huán)血量而導(dǎo)致的稀釋作用，使孕婦血液中胎兒游離DNA濃度降低[5]；孕婦自身游離DNA總量隨體重指數(shù)按比例增加，而胎兒游離DNA不增加，即相當(dāng)于胎兒游離DNA濃度降低[6]。

目前無(wú)創(chuàng)DNA技術(shù)被傾向于定位為T21、T18和T13等常見染色體非整倍體的篩查手段，受檢者需要在給予充分咨詢、知情同意的情況下自愿選擇參加無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)。

對(duì)于本次研究無(wú)創(chuàng)結(jié)果與傳統(tǒng)胎兒染色體方法進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其中21-三體的準(zhǔn)確率最高，其次為18-三體和性染色體，13-三體的準(zhǔn)確率相對(duì)較差。研究發(fā)現(xiàn)18-三體、性染色體檢測(cè)穩(wěn)定性較差，受GC含量干擾所致[7]，Jiang F等[8]以標(biāo)準(zhǔn)Z-Score值為基礎(chǔ)，通過改進(jìn)染色體內(nèi)標(biāo)參照及計(jì)算方式，實(shí)現(xiàn)結(jié)果值變異系數(shù)小，一定程度上克服GC含量問題，提高和穩(wěn)定了18-三體及性染色體檢出率，而后繼研究需要我們不斷克服技術(shù)難題，并逐步推向臨床。綜上所述，胎兒染色體非整倍體無(wú)創(chuàng)基因檢測(cè)技術(shù)對(duì)于診斷 21-三體綜合征敏感性及特異性高，且因其為無(wú)創(chuàng)診斷，能有效緩解孕婦及家屬的心理負(fù)擔(dān)，故該檢測(cè)方法可應(yīng)用于唐氏綜合癥的早期產(chǎn)前診斷的新技術(shù)。

本次實(shí)驗(yàn)采用羊水核型分析和FISH技術(shù)對(duì)無(wú)創(chuàng)DNA進(jìn)行驗(yàn)證，核型和FISH的符合率為99%，只有1例結(jié)果不一致，F(xiàn)ISH結(jié)果為45,XO(35%)/ 46,XX，而核型結(jié)果為45,XO究其原因，這是因非整倍體細(xì)胞傳代培養(yǎng)時(shí)較正常細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，原有的正常細(xì)胞比例就會(huì)在傳代被稀釋，如分子技術(shù)很易檢測(cè)的45,XO/46,XX嵌合，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)后的核型分析為單純45,XO。抽臍血驗(yàn)證后以FISH結(jié)果為準(zhǔn)。FISH技術(shù)作為一個(gè)新的生物學(xué)診斷技術(shù)，可以對(duì)流產(chǎn)組織及產(chǎn)前診斷標(biāo)本進(jìn)行目標(biāo)染色體數(shù)目異常的檢測(cè)。本研究中通過和常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)方法的對(duì)比，F(xiàn)ISH技術(shù)顯現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：①檢測(cè)周期短，可以48～72小時(shí)出結(jié)果；②檢測(cè)成功率高，本研究中成功率達(dá)到了100%；③取材時(shí)間不受孕周限制；④檢測(cè)標(biāo)本不受限；⑤操作簡(jiǎn)便；⑥FISH技術(shù)是低嵌合體檢出判斷的金標(biāo)準(zhǔn)。但是FISH技術(shù)也有一定的局限性，只能檢測(cè)目標(biāo)染色體數(shù)目異常，對(duì)染色體結(jié)構(gòu)異常不能檢測(cè)。因此FISH技術(shù)作為獨(dú)立的產(chǎn)前診斷技術(shù)是有一定風(fēng)險(xiǎn)的。

因此對(duì)于國(guó)內(nèi)目前的技術(shù)現(xiàn)狀，做好孕婦產(chǎn)前診斷遺傳咨詢工作至關(guān)重要，根據(jù)孕婦的不同臨床情況做出不同的檢查項(xiàng)目。由于無(wú)創(chuàng)DNA 檢測(cè)技術(shù)的一些局限性[9,10]，所以，目前的胎兒染色體診斷以細(xì)胞遺傳學(xué)和FISH為主，無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)技術(shù)和基因芯片等技術(shù)可以對(duì)傳統(tǒng)方法進(jìn)行有益的補(bǔ)充，多種檢測(cè)方法聯(lián)合應(yīng)用，以提高產(chǎn)前診斷的準(zhǔn)確性、成功率。目前出現(xiàn)如此多的快速產(chǎn)前診斷技術(shù)，目的是促進(jìn)優(yōu)生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，而不應(yīng)成為臨床專業(yè)人員的障礙當(dāng)然也提出了更高的要求，如何選擇應(yīng)用這些技術(shù)，如何達(dá)到最優(yōu)的質(zhì)量控制，如何做到檢測(cè)前后最充分的咨詢等。

[1]邊旭明.胎兒染色體非整倍體的無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)[J].實(shí)用婦產(chǎn)科雜志,2013,29(5)：330-333.

[2]楊燦鋒，石錦平，肖建平,等.無(wú)創(chuàng)DNA測(cè)序與傳統(tǒng)方法在產(chǎn)前診斷應(yīng)用中的比較[J].中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2014，22(11):27-28.

[3]Palomaki GE，Kloza EM，Lambert-Messerlian GM,et al.DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome: An international clinical validation study[J].GenetMed,2011,13(11):913-920.

[4]Palomaki GE,Deciu C,Kloza EM,et al.DNA sequencing of maternal plasma reliably identifies trisomy 18 and trisomy 13 as well as Down syndrome: an internationalcollaborativestudy[J].Genet Med,2012,14(3):296-305.

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[7]Chen EZ，Chiu RW，Sun H，et al.Noninvasive prenatal diagnosisof fetal trisomy 18 and trisomy 13 by maternal plasma DNA sequencing[J].PLos One,2011,6(7):e21791．

[8]Jiang F,Ren J,Chen F,et al.Noninvasive fetal trisomy ( NIFTY) test: an advancednoninvasive prenatal diagnosis methodology for fetal autosomaland sex chromosomal aneuploidies[J].BMC Med Genomics,2012,5:57

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[10]Fan HC,GuW,WangJ,et al.Non-invasive prenatal measurementof the fetal genome[J].Nature，2012,487(10):320-324.

編輯：宋文穎

ObjectiveTo investigate the clinical application value of non-invasive gene detection of aneuploidy in fetal as noninvasive prenatal diagnosis． MethodThe amniocentesis and karyotyping results in Xijing Hospital from January 2012 to December 2014 were retrospectively analyzed.The only indication for amniocentesis in these group of woman was positive NIPS (Non-invasive prenatal screening) results.84 case of positive NIPS results were required for validating by fetal karyotype analyzing through invasive procedures such as amniotic cavity.The NIPT result were compared with the fetal karyotyping and FISH for verification and analysis，telephone follow up after fetus birth for the chromosome result .ResultsAbnormal 84 cases did amniotic fluid puncture or umbilical cord puncture and chromosome karyotype analysis,48 cases of trisomy 21 were detected that 2 cases were false positive,11 cases of trisomy 18 were detected that 4 cases were false positive，4 cases trisomy 13 were detected that 2 cases were false positive，21cases abnormal in sex chromosome were detected that 6 cases were false positive.ConclusionsSequencing technology of free fetal DNA in pregnant women，detection of trisomy 21、trisomy 18 、trisomy 13 and abnormal in sex chromosome accuracy up to 95.8%,73%,71%and 50%.Non-invasive detection of DNA was an effective method of prenatal screening of trisomy 21，but on trisomy 18、13 trisomy and sex chromosome detection rate、accuracy rate to be further improved existing technologies.

noninvasive DNA prenatal testing；abnormal test results；karyotype analysis；FISH

10.13470/j.cnki.cjpd.2016.02.005

陜程(L03-09)

張建芳，E-mail：zhzhhao@163.com

R714.53

A

2016-03-24)