盧建 黃偉偉 李怡 周偉寧 尹愛華

(廣東省婦幼保健院 醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東 廣州 510010)

染色體微陣列技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用

盧建 黃偉偉 李怡 周偉寧 尹愛華

(廣東省婦幼保健院 醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東 廣州 510010)

染色體微陣列技術(shù)是一種高分辨率、全基因組范圍的檢測技術(shù)，不僅可以檢測傳統(tǒng)染色體分析技術(shù)可以檢測的絕大多數(shù)染色體不平衡，而且能檢出亞顯微水平的拷貝數(shù)變異。本文針對(duì)該技術(shù)的平臺(tái)分類、產(chǎn)前診斷應(yīng)用中的優(yōu)勢和不足、結(jié)果分類與解讀，面臨的挑戰(zhàn)、臨床適應(yīng)證、倫理及遺傳咨詢方面做一概述。

染色體微陣列技術(shù)(chromosomal microarray analysis，CMA)是一種高分辨率、全基因組范圍的檢測技術(shù)，不僅可以檢測傳統(tǒng)染色體分析技術(shù)可以檢測的絕大多數(shù)染色體不平衡，而且能檢出亞顯微水平的拷貝數(shù)變異(copy number variants，CNV)，即通常所說的染色體微小片段缺失或重復(fù)等。近來研究表明CNV普遍存在于我們的基因組中，且在人類遺傳性疾病中發(fā)揮重要的作用[1]。因此CMA已被推薦作為一線技術(shù)應(yīng)用于神經(jīng)發(fā)育性疾病和先天發(fā)育異常等人類遺傳性疾病的檢測。隨著在兒童遺傳性疾病檢測的經(jīng)驗(yàn)積累，CMA技術(shù)逐漸被應(yīng)用到產(chǎn)前診斷中，為產(chǎn)前診斷提供了新的途徑，其在對(duì)染色體的數(shù)目異常、片段缺失和重復(fù)的檢測方面比傳統(tǒng)的染色體核型分析具有明顯的優(yōu)越性。

1 CMA技術(shù)平臺(tái)分類

根據(jù)設(shè)計(jì)原理的不同，目前主要有2種技術(shù)平臺(tái)應(yīng)用于產(chǎn)前診斷。一種是比較基因組雜交微陣列芯片(comparative genomic hybridization array，CGH array)，其原理是將待測樣本DNA與正常對(duì)照樣本DNA分別標(biāo)記、與芯片探針進(jìn)行競爭性雜交后獲得定量的拷貝數(shù)檢測結(jié)果；另一種是單核苷酸多態(tài)性微陣列芯片(single nucleotide polymorphism array，SNP array)，其原理則只需將待測樣本DNA與芯片探針進(jìn)行雜交，然后和內(nèi)部參照數(shù)據(jù)進(jìn)行比較獲得定量的拷貝數(shù)檢測結(jié)果及SNP型結(jié)果。CGH array能夠很好地檢出CNV，而SNP array 除了能夠檢出CNV外，還能夠檢測出大多數(shù)的單親二倍體(uniparental disomy，UPD)、三倍體及一定比例的嵌合體[2]。近年來，為了提高檢測的敏感性、特異性，2種平臺(tái)相互借鑒對(duì)方優(yōu)點(diǎn)，因此設(shè)計(jì)的芯片多同時(shí)含有CNV和SNP探針。

2 CMA在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用優(yōu)勢

傳統(tǒng)的染色體分析技術(shù)主要用于檢測染色體非整倍體、大片段缺失或重復(fù)、平衡或非平衡性易位和倒位等，但受顯帶分辨率的限制，產(chǎn)前染色體核型分析可發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)異常長度通常都在10Mb以上，并且在進(jìn)行染色體核型分析前一般需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，檢測結(jié)果一般在取樣2～3周后才能得到。

相較傳統(tǒng)的染色體分析技術(shù)，CMA具有更高的分辨率，可以發(fā)現(xiàn)低至50～100kb的片段缺失或重復(fù)[3]。對(duì)一些核型分析診斷為原發(fā)性平衡易位攜帶者，CMA也可以幫助檢測易位斷裂點(diǎn)是否存在微小缺失或重復(fù)。另外CMA可用于非培養(yǎng)產(chǎn)前樣本的檢測，從而降低檢測周期。特別是一些稽留流產(chǎn)或胚胎停育組織，細(xì)胞培養(yǎng)非常困難，核型分析往往無法獲得結(jié)果而CMA則可獲得較好結(jié)果。

一些大樣本量研究比較了CMA和傳統(tǒng)核型分析在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)CMA對(duì)分析產(chǎn)前超聲發(fā)現(xiàn)胎兒結(jié)構(gòu)畸形但染色體核型正常的病例發(fā)揮了突出作用。在一些多中心研究中[4]，對(duì)于核型結(jié)果正常樣本中，如果產(chǎn)前超聲提示異常，CMA結(jié)果提示6.5%(201/3090)的陽性率；對(duì)于高齡孕婦，其CMA陽性率是1.0%(50/5108)；其他因素如血清學(xué)篩查陽性、焦慮、染色體異常生育史等，其陽性率是1.1%(44/4164)。

3 CMA存在的不足

CMA通常用于檢測非平衡染色體異常，但無法檢測平衡性染色體重排，如易位或倒位。CMA也無法提供產(chǎn)生染色體不平衡的遺傳機(jī)制的信息，例如CMA發(fā)現(xiàn)21-三體，我們無法區(qū)分是單純性還是羅伯遜易位型21-三體，這些信息對(duì)再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估非常重要。對(duì)于低比例嵌合體和多倍體情況，CMA也存在漏檢可能，特別是CGHarray漏診可能性較高，而SNP array對(duì)于低比例嵌合體和三倍體的檢測則明顯好于CGHarray。同時(shí)，我們應(yīng)了解CMA并不能檢出所有的CNV，例如1、9、16及Y染色體次縊痕區(qū)域和D組、E組染色體短臂等區(qū)域，這些區(qū)域并未設(shè)置檢測探針；對(duì)于低于檢測分辨率的CNV也無法檢出。另外CMA也無法檢測單基因遺傳病的點(diǎn)突變異常、基因表達(dá)異常和甲基化異常。

4 CMA的結(jié)果分類與解讀

按照美國遺傳協(xié)會(huì)推薦的分類標(biāo)準(zhǔn)[5]，CNV結(jié)果可分為良性CNV、致病性CNV、臨床意義不明CNV三大類。其基本原則如下：①良性CNV：涉及的CNV在DGV數(shù)據(jù)庫或內(nèi)部數(shù)據(jù)庫中的發(fā)生率>1%；或該CNV已在多個(gè)同行審議的出版物或經(jīng)審校的數(shù)據(jù)庫中報(bào)告為良性；或CNV不包含任何基因或重要的基因組成部分。②致病性CNV：該CNV已在多個(gè)同行審議的出版物或經(jīng)審校的數(shù)據(jù)庫中報(bào)告為致病性，或缺失中包含因單倍劑量不足(haploinsufficiency)而致病的基因或基因的一部分，或重復(fù)中包含三倍劑量敏感基因的全部。③臨床意義不明性CNV：此類變異不符合致病條件也不符合良性條件，文獻(xiàn)報(bào)道中的結(jié)論尚未一致，暫沒有足夠的證據(jù)做肯定的分類。

具體區(qū)分可以參考一些病例報(bào)道、病例分析等資料，以及一些公共數(shù)據(jù)庫，如國際公共病理性CNV數(shù)據(jù)庫(Database of genomic variation and Phenotype in Humans using Ensembl Resources，DECIPHER) 、國際公共良性CNV數(shù)據(jù)庫( database of genomic variants，DGVs) 、人類遺傳學(xué)細(xì)胞遺傳學(xué)微陣列委員會(huì)在線數(shù)據(jù)庫( internationalstandard cytogenomic array consortium，ISCA) 、人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫( online mendelian inheritance in man，OMIM) 等，這些不斷完善的數(shù)據(jù)庫對(duì)規(guī)范和明確CMA結(jié)果的解釋及遺傳咨詢起著重要作用。

SNP array可以發(fā)現(xiàn)雜合性丟失(loss of heterozygosity，LOH )，LOH產(chǎn)生原因主要有3種[6]：①血源同一(identity by descent，IBD)：這是由于父母是遠(yuǎn)親關(guān)系。表現(xiàn)為小的LOH分散在少數(shù)幾條染色體上面。②近親關(guān)系(consanguinity)：這是由于父母親緣關(guān)系較近。在基因組中表現(xiàn)為許多染色體上有較大的LOH片段。雖然這些LOH本身不致病，但會(huì)增加隱性遺傳病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[7]。③單親二倍體(uniparental disomy，UPD)：是指某一染色體的兩個(gè)拷貝均來源于父親或母親。包含異源單親二倍體(heterodisomy)和同源單親二倍體(isodisomy)兩種情況。CMA只能檢測出同源單親二倍體。目前已知第6、7、11、14、15及20號(hào)染色體含有印跡致病基因[8]，當(dāng)發(fā)生UPD時(shí)認(rèn)為是致病性的，其余染色體的UPD臨床意義均不明確。

5 CMA 在產(chǎn)前診斷中面臨的挑戰(zhàn)

CMA用于產(chǎn)前領(lǐng)域的目的不同于用于產(chǎn)后，產(chǎn)后檢測主要是用來解釋患者的臨床癥狀，幫助找到病因；而用于產(chǎn)前領(lǐng)域則是為了預(yù)測胎兒結(jié)局或是排除胎兒存在一些明確的染色體異常。因此用于產(chǎn)前時(shí)，有限的影像學(xué)資料和臨床信息導(dǎo)致很難解釋CNV的臨床相關(guān)性及預(yù)測胎兒出生后的臨床表型，這也就導(dǎo)致一些臨床意義不明的CNV常給家庭帶來巨大的壓力和焦慮，有些甚至在超聲無明顯異常的情況下考慮選擇終止妊娠。

CMA檢測結(jié)果中臨床意義不明CNV檢出率約為1%～2%[9,10]。在產(chǎn)前診斷中，評(píng)估胎兒臨床意義不明CNV對(duì)胎兒的影響首先需要確定是否新發(fā)突變，因此需對(duì)胎兒父母進(jìn)行進(jìn)一步檢測，這勢必增加家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)及不必要的擔(dān)憂。同時(shí)我們應(yīng)了解，家系調(diào)查并不總能提供足夠的信息，因?yàn)樵诟改鸽p方及兄弟姐妹間特定的遺傳學(xué)改變可能對(duì)表型有不同影響；另外，在個(gè)體基因組中其他區(qū)域的畸變的聯(lián)合效應(yīng)也會(huì)對(duì)結(jié)果的解釋造成困擾。因此，CMA結(jié)果的判斷和解釋在產(chǎn)前診斷中面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，對(duì)于臨床意義不明的CNV我們無法給出準(zhǔn)確的解釋；即便一些CNV明確致病，但由于其臨床表現(xiàn)多樣性，導(dǎo)致我們很難準(zhǔn)確預(yù)測胎兒出生后可能出現(xiàn)的表型。這些都給臨床實(shí)際工作中帶來挑戰(zhàn)。但幸運(yùn)的是隨著CMA應(yīng)用的增多，臨床意義不明CNV檢出率呈明顯下降趨勢[11]。隨著對(duì)CNV數(shù)據(jù)的積累必將進(jìn)一步減少臨床意義不明CNV的報(bào)告比例。

6 CMA技術(shù)的臨床適應(yīng)證

目前，各國相關(guān)行業(yè)協(xié)會(huì)給出的臨床適用指征并不完全一致，我國產(chǎn)前診斷協(xié)作組給出的臨床適應(yīng)證包括[12]：①產(chǎn)前超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒結(jié)構(gòu)異常，建議在胎兒染色體核型分析的基礎(chǔ)上進(jìn)行，如核型分析正常，則建議進(jìn)一步行CMA檢查；②對(duì)于胎死宮內(nèi)或死產(chǎn)、需行遺傳學(xué)分析者，建議對(duì)胎兒組織行CMA檢測；③對(duì)于胎兒核型分析結(jié)果不能確定情況下，建議采用CMA技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步分析以明確診斷。從中我們可以看出，CMA在我國還只是染色體核型分析的輔助檢測手段，并未像西方發(fā)達(dá)國家推薦作為超聲異常胎兒的一線檢查手段，考慮可能還是由于目前CMA技術(shù)在我國普及度低有關(guān)，另一方面就是檢測費(fèi)用遠(yuǎn)高于核型分析，限制了其廣泛應(yīng)用。

7 CMA檢測倫理問題和遺傳咨詢

在產(chǎn)前診斷領(lǐng)域，CMA的應(yīng)用常常要面對(duì)一些倫理問題，如當(dāng)檢測到臨床意義不明CNV時(shí)，是否會(huì)對(duì)孕婦和胎兒造成超出接受程度之外的傷害風(fēng)險(xiǎn)？是否需要隱瞞一些檢測結(jié)果信息等，這些問題還需要進(jìn)一步討論。例如CMA檢測到臨床意義不明CNV，目前還無法評(píng)估對(duì)胎兒帶來的可能風(fēng)險(xiǎn)。若告知孕婦我們對(duì)該片段缺失是否正?；蛘咧虏∫粺o所知，將會(huì)增加孕婦的精神壓力，同時(shí)也會(huì)影響到她對(duì)妊娠的決定。在這種情況下，怎樣去把握報(bào)告尺度問題，急需要我們?nèi)ニ伎肌Ｄ壳霸跊]有一個(gè)統(tǒng)一的報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)前，檢測前的遺傳咨詢必不可少，告知CMA的優(yōu)勢與不足，可能存在的問題(如，可能檢出臨床意義不明的CNV、成年發(fā)病的CNV、胎兒為某些疾病的攜帶者等情況)，報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)(推薦產(chǎn)前領(lǐng)域下盡量減少臨床意義不明CNV的報(bào)告，以免造成胎兒父母的不必要的恐慌)等；檢測后我們應(yīng)通過遺傳咨詢、感情支持、事件展望等幫助孕婦，而不應(yīng)該家長式直接指導(dǎo)孕婦采取何種行動(dòng)(13)。

8 結(jié)論

總而言之，CMA技術(shù)可以對(duì)產(chǎn)前樣本進(jìn)行全基因高分辨率的掃描，相對(duì)于傳統(tǒng)核型分析大大提高了檢出率。且該技術(shù)對(duì)標(biāo)本要求不高，可對(duì)死胎組織進(jìn)行分析；無需培養(yǎng)則避免了培養(yǎng)過程造成的異常，同時(shí)也縮短了檢測時(shí)間。盡管很多人擔(dān)心CMA芯片檢測出來的臨床意義不明的CNV片段對(duì)孕婦會(huì)造成多方面的壓力，但因其具有其他技術(shù)不可比擬的優(yōu)勢，且隨著遺傳咨詢能力的提高，CMA技術(shù)必定會(huì)被廣泛應(yīng)用于產(chǎn)前診斷。

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編輯：宋文穎

10.13470/j.cnki.cjpd.2016.04.003

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2016-10-16)