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(南華大學公共衛(wèi)生學院，湖南 衡陽 421001)

·文獻綜述·

基于功能核酸的金屬離子生物傳感技術進展

朱玉鳳，王小鳳，王永生*

(南華大學公共衛(wèi)生學院，湖南 衡陽 421001)

基于功能核酸的生物傳感技術近年取得了顯著的進步。本文對綜述了功能核酸在金屬離子傳感技術中的應用進展，重點介紹了熒光、比色和共振光散射三類傳感技術的新進展、新原理及其應用。

功能核酸； 金屬離子； 熒光傳感； 比色傳感； 共振光散射

功能核酸是通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術 (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX) 篩選得到的寡聚核苷酸片段，包括脫氧核酶(DNAzyme)，核酸適配體(aptamer)和適體酶(aptazyme)等[1-3]。功能核酸具有易于合成、穩(wěn)定性好、特異性強、便于修飾等特點，因而成為近年來的研究熱點。本文對近年來發(fā)展的金屬離子生物傳感技術進行了總結和評述。

1 熒光傳感技術

1.1標記型熒光傳感器熒光傳感技術具有靈敏度高、動態(tài)線性范圍寬和重現(xiàn)性好等優(yōu)點。熒光傳感器大多采用熒光標記技術，即在核酸適配體5′端和3′端分別標記熒光基團(F)和猝滅基團(Q)，或?qū)和Q分別標記到DNAzyme的酶鏈和底物鏈上，當靶分子引入后，核酸適配體或脫氧核酶的構象發(fā)生改變，導致體系的熒光強度發(fā)生改變，據(jù)此進行定量分析[4-5]。Magdalena S等[6]設計了一個分子信標檢測Hg2+，分子信標5′端和3′端分別標記熒光基團(FAM)和猝滅基團(DABCYL)，莖部由4對G-C堿基和1對T堿基組成，且T-T在莖干中間部分，只有體系中存在Hg2+時，分子信標才能形成穩(wěn)定的發(fā)夾結構，F(xiàn)AM靠近DABCYL，熒光值降低，據(jù)此建立靈敏的檢測Hg2+的方法。該方法操作簡便，但成本較高。由于傳統(tǒng)的熒光猝滅基團猝滅效率低，且標記猝滅基團也增加了實驗成本。因此，量子點、金納米和氧化石墨烯等新型高效猝滅劑受到了人們的青睞[7-9]。本課題組發(fā)現(xiàn)[10]，設計的富T序列寡核苷酸與Hg2+特異性識別后，形成的端基T-Hg2+-T結構，能猝滅5′端標記FAM的熒光，從而實現(xiàn)了對Hg2+的特異性檢測，不需標記猝滅基團，降低了實驗成本，方法新穎，快速，檢出限達到4.28 nM。

1.2非標記型熒光傳感器非標記熒光傳感技術是近年來又一研究熱點。這類傳感器主要是基于熒光染料與不同構象的功能核酸結合后，呈現(xiàn)不同的熒光強度[11-14]。應用較多的染料有N-methyl-mesoporphyrin IX (NMM)，SYBR Green I (SG),Picogreen (PG) 和 GeneFinder (GF) 等。Zhang等[11]基于Hg2+(或Ag+)能與胸腺嘧啶T(或胞嘧啶C)形成T-Hg2+-T (或C-Ag+-C) 結構，導致功能核酸的構象改變，生成的雙鏈體能與SG特異性結合，引起熒光強度的變化，從而建立了分別測定Hg2+和Ag+的生物傳感方法，并將此技術應用于“邏輯門”設計。本課題組[12]基于UO2+特異性脫氧核酶在缺乏UO2+時，能與SG特異結合，體系熒光強度迅速增強；加入UO2+后，引起底物鏈在rA堿基處斷裂，斷裂片段游離，SG被釋放出來，體系熒光強度急速降低，據(jù)此定量測定UO2+，檢出限達到0.52 nM，此方法靈敏度高，選擇性好。含有富G序列的寡核苷酸探針在適當條件下能夠形成G-四聚體，它能與NMM特異性結合導致熒光顯著增強。本作者發(fā)現(xiàn)[13]，在酸性環(huán)境下，UO22+能夠猝滅NMM的熒光，并抑制NMM與G-四聚體的作用，據(jù)此用來定量UO22+濃度，此法選擇性好，精密度高，但也存在檢出限較高的缺陷。隨后，應用氧化石墨烯來降低背景信號，同時，設計了RNA裂解型嵌合DNA酶(RCDzyme)，通過酶鏈循環(huán)來進一步放大信號，建立了酶鏈循環(huán)和氧化石墨烯雙重信號放大超靈敏檢測UO22+的生物傳感方法[14]，方法檢出限達到皮摩爾水平，遠低于其它已報道的生物傳感器。與標記熒光技術相比，這類熒光傳感技術無需標記，成本相對低廉，操作簡便，靈敏度高。

2 比色傳感技術

功能核酸的出現(xiàn)，使比色傳感技術取得了突破性的進展，方法的靈敏度從傳統(tǒng)方法的毫摩爾、微摩爾水平提高到納摩爾，甚至皮摩爾水平。由于比色傳感技術能夠快速、現(xiàn)場、實時監(jiān)測，無需昂貴的儀器，因而備受研究者關注。目前基于功能核酸檢測金屬離子的比色傳感器主要有兩大類。

2.1基于金屬納米粒子和功能核酸的比色生物傳感器金屬納米粒子，尤其是金納米粒子，其粒徑小、比表面積大、消光系數(shù)大、易于修飾，這一特點被廣泛用來發(fā)展比色傳感技術。Wu等[15]基于陽離子聚合物PDDA能夠結合Cd2+特異性核酸適配體(Cd-4)，加入Cd2+后，Cd-4變構為發(fā)夾結構，釋放出的PDDA與金納米作用，使金納米發(fā)生聚集，溶液顏色和吸光度值相應發(fā)生變化，以此定量測定Cd2+。該方法靈敏，快速，但穩(wěn)定性較差，易造成假陽性。相比之下，核酸適配體修飾的金納米因其更穩(wěn)定，特異性更好深受研究者歡迎。Li等[16]設計了金納米表面修飾Pb2+特異性DNAzyme復合物，結合氧化石墨烯(GO)對單雙鏈不同的吸附作用，建立了超靈敏檢測Pb2+的比色傳感器：當體系中沒有Pb2+時，金納米修飾Pb2+特異性DNAzyme能夠吸附到GO表面，金納米保持均勻分散狀態(tài)；當有Pb2+存在時，該復合物裂解成三個單鏈片段被GO吸附，此時金納米聚集，依據(jù)溶液顏色的變化來定量測定Pb2+。

2.2基于G-四聚體-hemin的類過氧化物酶活性建立的比色生物傳感器氯化血紅素 (hemin)與富含G堿基的核酸適配體結合，可形成具有類似過氧化物酶活性的DNA酶[17]，能快速催化過氧化氫介導的氧化作用。Sun等[17]以Pb2+穩(wěn)定的G-四聚體為探針，建立了測定血清中K+的傳感器，其原理是Pb2+誘導形成的更緊湊的G-四聚體不能結合hemin，而K+取代Pb2+形成的G-四聚體能夠結合hemin，具有較強的催化H2O2氧化ABTS(2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)顯色的能力。該方法特異性好。本課題組[18]設計了富含G(鳥嘌呤)和T(胸腺嘧啶)的功能化嵌合核酸適體(functional chimera aptamer,FCA)，在沒有Hg2+離子存在時，F(xiàn)CA以G-四聚體結構形式存在，能夠與hemin結合形成具有過氧化物酶活性的DNAzyme；當加入Hg2+后，T-Hg-T發(fā)夾結構阻止了G-四聚體的形成，不能形成DNAzyme，根據(jù)溶液顏色深淺或吸光度大小定量測定Hg2+，方法線性范圍寬，靈敏度高，檢出限達到2.65 nM。

3 共振光散射技術

共振光散射技術具有靈敏度高、分析速度快、所需儀器設備簡單等優(yōu)點，已廣泛應用于環(huán)境、食品、藥物分析和生物醫(yī)學等領域。近年來，功能核酸與納米技術結合，促進了共振光散射技術在金屬離子檢測中的廣泛應用。Cai等[19]將富含G堿基的單鏈核酸適配體(ssDNA)與納米銀結合，建立了共振光散射測定K+的傳感方法：在高濃度的NaCl溶液中，納米銀被ssDNA保護而處于分散狀態(tài)，K+能誘導核酸適配體形成穩(wěn)定的G-四聚體結構，此時納米銀失去了保護而發(fā)生聚集，體系的共振光散射增強。該方法應用于實際尿樣中K+離子測定，取得了滿意的效果。本課題組基于鈾特異性DNA酶通過金硫鍵組裝在金納米粒子上，形成金納米粒子復合物，在pH 4.5的MES緩沖溶液中，加入一定濃度的鈾酰離子，導致復合物在高鹽濃度下聚集，使體系的共振光散射強度增加，據(jù)此，建立了一種標記DNA酶-金納米粒子系統(tǒng)共振光散射法檢測鈾酰離子的新方法[20]。該方法可檢出納摩爾級的鈾酰離子，檢出限低，穩(wěn)定性好。UO22+特異性DNA酶的底物鏈含有核糖核苷酸堿基rA，它容易被核酸酶水解，因此實驗過程中需對所有的試劑、器械進行去核酸酶的處理，這加大了分析檢測的工作量和實驗成本。為了克服這一缺點，應用UO22+特異性核酸適配體(底物鏈不含rA堿基)，建立了測定環(huán)境水樣中痕量UO22+的共振光散射傳感方法[21]。該方法檢出限低，試劑和器械無需進行去核酸酶處理，操作簡便，快速。功能核酸技術和共振光散射技術的結合，在金屬離子檢測方面具有重要的發(fā)展前景。

除了上述傳感技術外，不少研究者應用功能核酸建立了多種測定金屬離子的傳感方法，如化學發(fā)光、電化學、表面等離子體共振和無線傳感法等[22-26]，本文不一一贅述。

4 展 望

基于功能核酸測定金屬離子的傳感技術簡便快速，靈敏度高，特異性好，但仍存在一些不足，主要表現(xiàn)在：①已開展的工作主要集中在理論研究及實驗室階段，推廣應用于實際樣品檢測還需作進一步的工作；②研究主要集中在Hg2+，Pb2+，Cu2+，K+，UO22+，Ag+和Cd2+等，對其它金屬離子的研究相對較少；③研究方法多限于比色法、熒光法和共振光散射光譜法等。因此，今后的研究工作可望在以下方面進一步深入和發(fā)展：①進一步完善和發(fā)展SELEX篩選技術，篩選出更多金屬離子特異性的功能核酸，應用于金屬離子傳感器的構建；②進一步開發(fā)金屬離子傳感新材料，深入研究金屬離子傳感新原理、新技術和新方法，推廣應用于實際工作中，擴大應用領域；③開發(fā)簡便、易攜帶、靈敏度高、檢測范圍寬且穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好的生物傳感器，滿足經(jīng)濟、社會發(fā)展的需要，這仍然是今后金屬離子檢測研究領域應著重解決的一個問題。

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10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.02.026

2015-12-30；

2016-03-01

國家自然科學基金資助項目(No.21177052).

*通訊作者，E-mail:yongsheng.w@tom.com.

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蔣湘蓮)