董瓅瑾 樊嶸

(武警后勤學(xué)院科研部，天津 300309)

·綜述·

膠質(zhì)瘤干細胞輻射抗性機制的研究進展

董瓅瑾 樊嶸*

(武警后勤學(xué)院科研部，天津 300309)

放射治療; 膠質(zhì)瘤干細胞; 輻射抵抗; 微環(huán)境

腫瘤是包含不同表型和功能的腫瘤細胞的混合物。在已發(fā)現(xiàn)的諸多類型腫瘤中，腦腫瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重大疾病，通?？梢栽斐苫颊唢B內(nèi)壓升高，壓迫腦組織，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，嚴重威脅著患者的生命。目前，針對腦腫瘤的治療手段主要包括手術(shù)治療結(jié)合化療和放療的方法。由于腦腫瘤侵襲性生長的特點，手術(shù)不能達到完全切除的效果；化療效果由于血腦屏障影響了抗癌藥物的充分轉(zhuǎn)運及腫瘤的耐藥性而不明顯；放射治療是最主要的術(shù)后輔助治療手段，但是由于某些腫瘤細胞對射線具有抵抗性，而加大劑量又會造成對周圍正常腦組織的損傷，因此增加腫瘤組織對放射治療的敏感性對于提高放療效果和治愈率尤為重要。而膠質(zhì)瘤干細胞的存在，導(dǎo)致了腫瘤的復(fù)發(fā)和預(yù)后不良，本文針對近年來膠質(zhì)瘤干細胞的輻射抗性機制研究綜述如下。

一、腫瘤干細胞的發(fā)現(xiàn)

1967年，研究人員將早期小鼠胚胎細胞植入成年小鼠睪丸后，發(fā)展成為畸胎瘤，該研究為腫瘤起源于干細胞提供了思路和證據(jù)。1997年Bonnet和Dick等首次從人類急性髓性白血病中分離出一類特殊的細胞，該群細胞只占整體的0.2%～1%，但是卻具有克隆形成能力和在免疫缺陷小鼠體內(nèi)形成移植瘤的能力，并且能分化成為其它白血病細胞。2001年Reya等提出了腫瘤干細胞假說，主張：腫瘤細胞包括大部分缺乏增殖分化能力的腫瘤細胞和一小部分特殊的腫瘤細胞，這小部分細胞具有自我更新、不對稱分裂和多項分化潛能等干細胞特性，是具有高致瘤性的腫瘤細胞，被成為腫瘤干細胞(cancer stem cells, CSC)或腫瘤起始細胞。2003年Clarke等發(fā)現(xiàn)CD44+CD24-低乳腺癌腫瘤干細胞是腫瘤發(fā)生的細胞群，通過接種免疫缺陷小鼠可以產(chǎn)生新的腫瘤，而大部分腫瘤細胞則不能。2009年Schatton等[1]將腫瘤干細胞的特征歸納如下：①發(fā)起腫瘤和驅(qū)動新生物增殖；②通過自我更新產(chǎn)生自身無限拷貝；③有能力分化為非干細胞子代腫瘤。隨后，越來越多的研究為腫瘤干細胞的存在提供了證據(jù)。

二、膠質(zhì)瘤干細胞的鑒定

膠質(zhì)瘤(glioma)是增殖迅速、侵潤性高、血管生長豐富、治療抵抗、預(yù)后差及最具侵襲性的人類惡性病變。2002年報道了第一個證明神經(jīng)膠質(zhì)腦腫瘤內(nèi)干細胞樣細胞存在的實驗，這些惡性腫瘤具備能夠在正常干細胞培養(yǎng)條件下形成克隆的能力，也具備可以被誘導(dǎo)分化為星形細胞和其它神經(jīng)細胞的能力。Singh等發(fā)現(xiàn)從膠質(zhì)瘤樣本中分離的CD133+細胞有很高的致瘤性，向非肥胖糖尿病/嚴重聯(lián)合免疫缺陷(non-obese diabetes-SCID mice, NOD-SCID)小鼠腦內(nèi)注射100個這樣的細胞足以引起腦腫瘤的形成，其表型與人源樣本相同且可連續(xù)接種；相反，挑選105個CD133-細胞卻不能產(chǎn)生腫瘤[2]。CD133是普通神經(jīng)干細胞的標志，膠質(zhì)瘤樣本中的CD133+細胞具有自我更新特性和體內(nèi)成瘤性。對臨床膠質(zhì)瘤樣本分析發(fā)現(xiàn)，組織分級、病人年齡和切除程度與CD133表達密切相關(guān)，CD133的表達和神經(jīng)球的形成能力是死亡高風(fēng)險的評估因素，表達CD133和nestin的膠質(zhì)瘤患者生存率明顯降低。

三、膠質(zhì)瘤干細胞的輻射抗性機制

放射治療用于臨床已經(jīng)超過一個多世紀了，雖然放療仍作為控制腫瘤生長的一個有力工具，但是和大多數(shù)抗腫瘤方法一樣，放療會造成腫瘤的輻射抗性。關(guān)于腫瘤輻射抗性的最新解釋是由于類似于干細胞樣腫瘤細胞的存在，這類腫瘤干細胞的另一個重要特征就是CSC比非CSC表現(xiàn)出對放療、化療的抵抗，是腫瘤治療失敗和復(fù)發(fā)的原因。目前研究發(fā)現(xiàn)影響膠質(zhì)瘤干細胞(glioma stem cells, GSC)輻射抗性的原因來自兩個方面：GSC自身特性和微環(huán)境(microenvironment-stem cell unit)的影響。

1.膠質(zhì)瘤干細胞的自身輻射抗性：膠質(zhì)瘤干細胞抵抗放射治療的證據(jù)源自一項實驗，該實驗中有10個患者都在大劑量伽馬刀治療前后經(jīng)歷手術(shù)切除，腫瘤治療后發(fā)現(xiàn)CD133+細胞比例明顯增加[3]。體外2Gy照射并沒有影響CD133+細胞的致瘤性，而5Gy照射后引發(fā)腫瘤所需的最小數(shù)目細胞比例增加。通過研究從膠質(zhì)瘤中分離出的原代細胞克隆形成能力發(fā)現(xiàn)，CD133+細胞比CD133-細胞克隆形成能力強。Bao等通過體內(nèi)和體外實驗證實CD133+膠質(zhì)瘤細胞照射后存活比率較CD133-膠質(zhì)瘤細胞明顯增加；CD133+膠質(zhì)瘤細胞比CD133-膠質(zhì)瘤細胞相比，前者凋亡率更低，照射后細胞周期檢查點活化能力更強，DNA單、雙鏈斷裂的修復(fù)能力也更強。

近來的研究發(fā)現(xiàn)以下幾條信號通路可能參與了膠質(zhì)瘤干細胞輻射抵抗：①細胞周期調(diào)節(jié)因子/檢測點激酶2/p53通路 (ataxia-telangiectasa mutated protein/checkpointskinase 2/p53, ATM/Chk2/p53)：人膠質(zhì)瘤中編碼DNA損傷修復(fù)(DNA damage repair, DDR)通路的基因突變率增加，ATM/Chk2/p53通路組分的缺失加速膠質(zhì)瘤小鼠模型腫瘤的形成并增加了膠質(zhì)瘤的輻射抗性[4]。②磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素受體通路(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinaseB/mammalian target of rapamycin, PI3K/Akt/ mTOR)：膠質(zhì)瘤干細胞中PI3K/Akt通路比非膠質(zhì)瘤干細胞中活性更高。關(guān)于髓母細胞瘤的實驗發(fā)現(xiàn)，表達nestin的血管周干細胞在照射后存活增加，PI3K/Akt通路活化，細胞周期發(fā)生阻滯，使細胞有更多的時間對損傷進行修復(fù)，而Akt信號通路的抑制導(dǎo)致血管周細胞在照射后更容易發(fā)生凋亡。③核因子-κB通路(nuclear factor kappa B, NF-kB)：該通路在細胞應(yīng)對電離輻射(ionizing radiation, IR)時發(fā)揮關(guān)鍵作用，是DNA損傷活化的促存活機制之一，與腫瘤抗凋亡和腫瘤存活有關(guān)。膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastoma, GBM)患者CD44表達，NF-kB活化表現(xiàn)出輻射應(yīng)答降低，提示抑制NF-kB活性可能是一個治療GBM的途徑[5]。④Notch通路：Notch介導(dǎo)的髓細胞白血病基因-1(myeloid cell leukemia-1, Mcl-1)上調(diào)對膠質(zhì)瘤來源細胞的治療抗性有關(guān)[6]。 分泌酶抑制劑使膠質(zhì)瘤干細胞對輻射更加敏感，但是對非干細胞性膠質(zhì)瘤細胞則沒有作用。 分泌酶抑制劑可以通過Notch進行靶向切割降低Mcl-1水平，通過降低CD133+細胞比例，增加細胞凋亡，達到對髓母細胞瘤的治療效果。另一方面，Notch1或Notch2的沉默使膠質(zhì)瘤干細胞對輻射敏感，破壞成瘤。而表達Notch1或Notch2活性細胞內(nèi)domain增加膠質(zhì)瘤干細胞輻射抗性。

此外，自吞噬也是CD133+GSC放射保護機制之一。Lomonaco等發(fā)現(xiàn)，照射后CD133+GSC細胞比CD133-細胞表達更高水平的自吞噬蛋白，抑制自吞噬則增加CD133+GSC輻射敏感性，降低其成球能力。輻射可以引起DNA活性蛋白激酶C( DNA-activated protein kinase c, DNA-PKcs)沉默的膠質(zhì)瘤干細胞發(fā)生大量自吞噬[7]。

2.微環(huán)境對膠質(zhì)瘤干細胞輻射抗性的影響：近年來，關(guān)于腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)，各種外源應(yīng)激因子包括缺氧、炎癥、抗腫瘤治療和/或內(nèi)在機制等都能啟動腫瘤細胞再編程，改變其自我更新和分化能力。

通過對體外培養(yǎng)和顱內(nèi)接種腫瘤的CD133+細胞進行照射，Jamal等發(fā)現(xiàn)體內(nèi)H2Ax foci水平下降的更快。H2Ax foci是DNA損傷評判的金標準，其水平的高低直接反應(yīng)DNA損傷的嚴重程度。該實驗結(jié)果表明顱內(nèi)接種腫瘤的CD133+細胞DNA修復(fù)能力更強，這提示膠質(zhì)瘤干細胞和正常干細胞相似，與微環(huán)境構(gòu)成適合其生存的“龕”(niche)，這對其維持干細胞特性，保持輻射抗性具有重要意義[8]。腫瘤微環(huán)境的動態(tài)變化可能決定了正常干細胞的表型和功能特性向惡性細胞轉(zhuǎn)化，促進腫瘤發(fā)展和腫瘤細胞遷移[9]。腫瘤微環(huán)境由多種組分組成，包括免疫細胞、細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)、血管組分、一氧化氮(nitric oxide, NO)及缺氧等，每一個都可能對CSC輻射抗性有幫助。除了與內(nèi)皮細胞相互作用外，血管周區(qū)域的膠質(zhì)瘤干細胞也和細胞外基質(zhì)組分相互作用。

與內(nèi)皮細胞相互作用： 一方面，膠質(zhì)瘤干細胞通過血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)在內(nèi)皮細胞刺激下有促血管生成的作用。CD133+GSC通過增加VEGF表達促進腫瘤血管形成，而中和VEGF的抗體vevacizumab可以特異性抑制GSC血管發(fā)生。另一方面，內(nèi)皮細胞幫助維持膠質(zhì)瘤的干細胞特性。Hovinga等[10]利用三維器官外植系統(tǒng)對膠質(zhì)瘤樣本進行研究發(fā)現(xiàn)，模型中內(nèi)皮細胞的減少使單個細胞的成球能力下降50%以上。通過不同細胞類型共培養(yǎng)成球?qū)嶒炑芯堪l(fā)現(xiàn)，與內(nèi)皮細胞的共培養(yǎng)可能維持CD133+/nestin+腦腫瘤細胞自我更新。經(jīng)過3Gy照射后單培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞比與膠質(zhì)瘤細胞共培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞凋亡率更高。

與ECM組分相互作用： ECM組分主要作用是為調(diào)控輻射應(yīng)答蛋白提供場所；作為腫瘤細胞內(nèi)照射后促存活整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的信號級聯(lián)反應(yīng)活化的平臺；形成有利于照射后存活細胞增殖的“龕”。在整聯(lián)蛋白 1、αv 3和αv 5的表達和活化情況下膠質(zhì)瘤細胞輻射抗性增加。鍵糖蛋白C照射后表達增加，而且有膠質(zhì)瘤干細胞存在的血管周"龕"鍵糖蛋白C表達也增加。鍵糖蛋白C通過刺激細胞增殖抵消受照細胞死亡。過表達鍵糖蛋白C的膠質(zhì)瘤患者存活率降低，而低表達鍵糖蛋白C的患者存活率增加[11]。

與NO相互作用：利用血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor, PDGF )誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤小鼠模型實驗研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮型一氧化氮合酶 (endothelial nitric oxide synthase, eNOS)與內(nèi)皮細胞共定位，且內(nèi)皮細胞被表達nestin、Notch和NO受體可溶性鳥苷酸環(huán)化酶的腫瘤細胞所包圍，NO活化Notch通路并促進原代培養(yǎng)的鼠膠質(zhì)瘤細胞干細胞特性[12]?？赡苎苤?龕"NO合成的增加活化了Notch通路，增加了鄰近膠質(zhì)瘤干細胞的輻射抗性。

與缺氧相互作用： 缺氧條件下，自由基更容易與H+反應(yīng)，恢復(fù)原始狀態(tài)，降低DNA損傷的水平。在缺氧應(yīng)激中存活的腫瘤細胞產(chǎn)生促存活反應(yīng)，這些反應(yīng)由應(yīng)對缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factors, HIF)家族的各種基因轉(zhuǎn)錄所誘導(dǎo)。膠質(zhì)瘤干細胞對缺氧有不同的反應(yīng)，實驗發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤干細胞HIF2α水平更高，HIF調(diào)控的基因也不同于非干細胞。膠質(zhì)瘤干細胞HIFs沉默導(dǎo)致干細胞特性降低。通過成瘤實驗發(fā)現(xiàn)，干擾素 或bevacizumab處理后瘤內(nèi)氧合作用的增加使腫瘤的輻射敏感性提高[13]。因此，缺氧條件可能維持和加強了膠質(zhì)瘤干細胞內(nèi)細胞特性和輻射抗性。

四、展望

隨著對膠質(zhì)瘤研究的不斷深入，越來越多的研究證實GSC對膠質(zhì)瘤的放射治療至關(guān)重要，GSC的消滅與否直接關(guān)系著膠質(zhì)瘤能否徹底根治，而目前這一問題的解決仍面臨巨大的挑戰(zhàn)。首先，GSC輻射抵抗涉及到復(fù)雜的調(diào)控作用，不僅有上面提到的損傷修復(fù)通路及微環(huán)境作用，還有其它一些分子的參與，例如：包括多梳家族成員(polycomb group, PcG)也參與了膠質(zhì)瘤干細胞的輻射抵抗作用。多梳家族包括胞質(zhì)分裂調(diào)控蛋白1 (polycomb repressive complex 1, PRC1)和胞質(zhì)分裂調(diào)控蛋白2 (polycomb repressive complex 2, PRC2)兩大復(fù)合物。近年來的研究發(fā)現(xiàn)DNA損傷附近有PcG富集，PcG在40%的輻射抵抗細胞中發(fā)揮功能，包括B淋巴瘤Mo-MLV插入?yún)^(qū)域1同族體 (Blymphoma Mo-MLV insertion region 1 homolog, Bmi1)、同族體8號染色體 (chromobox homolog 8, CBX8)、果蠅zeste基因增強子同源物2 (enhancer of zeste homolog 2, EZH2)等[14～16]。BMI1是多梳家族成員中的重要一員，是在神經(jīng)發(fā)育和腫瘤組織中發(fā)揮重要調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，F(xiàn)acchino等發(fā)現(xiàn)BMI1在CD133+膠質(zhì)瘤干細胞中高表達，通過募集方式操控DNA雙鏈斷裂應(yīng)答和非同源末端連接(non-homologous end-joining, NHEJ)蛋白引起細胞輻射抗性增加[17]。而且膠質(zhì)瘤細胞與腦微血管內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)有利于成瘤，內(nèi)皮細胞通過上調(diào)Bmi1促進膠質(zhì)瘤細胞向GSC轉(zhuǎn)化。EZH2是PRC2亞基之一，與有絲分裂激酶MELK(maternal embryonic leucine zipper kinase)在膠質(zhì)瘤中共表達，并且輻射可以明顯誘導(dǎo)其表達，且與患者預(yù)后呈負相關(guān)。MELK或FOXM1通過調(diào)控EZH2參與GSC輻射抗性，EZH2通過依賴MELK /FOXM1的方式保護膠質(zhì)瘤干細胞免于輻射誘發(fā)的細胞死亡[18]。EZH2是PRC2中的賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，是轉(zhuǎn)錄抑制因子，GSC中STAT3的活化必須經(jīng)過EZH2對其進行甲基化激活[19]。此外，調(diào)控多梳家族的microRNA也可能參與了膠質(zhì)瘤對輻射的抵抗。miRNA-128和SUZ12/Bmi1在正常腦和膠質(zhì)瘤干細胞中表達相反，miR-128通過阻止輻射對PRC組分的誘導(dǎo)表達，使膠質(zhì)瘤干細胞樣細胞輻射敏感性降低。同時，膠質(zhì)瘤模型鼠發(fā)病前腦組織的神經(jīng)干細胞中mir-128表達明顯降低[20]。microRNA-218在膠質(zhì)瘤中表達下調(diào)，而過表達miR-218后，膠質(zhì)瘤細胞中Bmi1表達下調(diào)，腫瘤細胞遷移、侵襲及增殖能力下降，GSC細胞的自我更新被破壞[21]。

因此，鑒于如此眾多復(fù)雜的因素參與了GSC的輻射應(yīng)答反應(yīng)，必須通過更多、更細致深入的研究去發(fā)現(xiàn)GSC輻射抵抗的機制，包括DNA損傷修復(fù)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、靶基因調(diào)控及與微環(huán)境相互作用的機制，構(gòu)建清晰的網(wǎng)絡(luò)機制圖；其次，在明確機制后，尋找出克服GSC輻射抗性的靶向分子，徹底解決膠質(zhì)瘤放療后復(fù)發(fā)的問題。相信解決了膠質(zhì)瘤干細胞放射抵抗的問題，不僅可以從根本上膠質(zhì)瘤的治愈，而且為其它腫瘤的根治提供良好的應(yīng)用前景。

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1671-2897(2016)15-471-03

國家自然科學(xué)基金青年項目資助項目(81201757)

董瓅瑾，講師，碩士，E-mail：dongdonglijin@126.com

*通訊作者：樊嶸，講師， 博士，E-mail：prosperity_39@sina.cn

R 739.4

A

2015-04-01；

2015-07-10)