陸宇，劉碩碩(泰州市第二人民醫(yī)院，江蘇泰州225599)

嬰幼兒血管瘤源性血管內(nèi)皮細(xì)胞系XPTS-1中p-Akt及Bcl-xL的表達(dá)及意義

陸宇，劉碩碩
(泰州市第二人民醫(yī)院，江蘇泰州225599)

摘要:目的觀察活化的蛋白激酶B(p-Akt)及B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-x基因長(zhǎng)片段(Bcl-xL)在嬰幼兒血管瘤源性血管內(nèi)皮細(xì)胞系(HemEC)XPTS-1中的表達(dá)變化并探討其意義。方法取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的XPTS-1細(xì)胞，經(jīng)特異性PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002處理的XPTS-1作為實(shí)驗(yàn)組，未經(jīng)處理的XPTS-1作為對(duì)照組，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組細(xì)胞周期分布和凋亡率，應(yīng)用Western blotting法檢測(cè)p-Akt和Bcl-xL在各組中的表達(dá)。結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加(P＜0.01)，S期和G2/M期細(xì)胞明顯減少(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組(P＜0.01);實(shí)驗(yàn)組p-Akt和Bcl-xL表達(dá)均比對(duì)照組明顯降低(P均＜0.01)。結(jié)論p-Akt及Bcl-xL在嬰幼兒血管瘤細(xì)胞中的表達(dá)明顯降低，二者可能在XPTS-1細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞:血管瘤;磷脂酰肌醇3激酶;磷酸化絲/蘇氨酸激酶; B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-x基因長(zhǎng)片段doi: 10.3969/j.issn.1002-266X.2015.33.009

嬰幼兒血管瘤(IH)是嬰幼兒較常見的良性腫瘤，根據(jù)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)及臨床表現(xiàn)，血管瘤的病程可分為增生期、消退期和消退完成期［1，2］，關(guān)于其增生、消退的機(jī)制目前尚未闡明。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在諸多生物過程中發(fā)揮作用，包括細(xì)胞凋亡、新陳代謝、細(xì)胞的生長(zhǎng)及增殖［3］，有研究［4］證實(shí)PI3K/Akt信號(hào)通路參與血管生成。LY294002是PI3K/Akt通路的特異性抑制劑，通過特異性抑制PIK3 p110亞單位的催化活性，可阻止PI3K的磷酸化過程，進(jìn)而阻止通路的激活。B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-x基因長(zhǎng)片段(Bcl-xL)是公

認(rèn)的抗凋亡蛋白，在惡性腫瘤中研究較多，血管瘤中研究較少，有文獻(xiàn)［5，6］報(bào)道，Bcl-xL可能參與血管形成。本研究中，我們通過阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路后檢測(cè)嬰幼兒血管瘤源性血管內(nèi)皮細(xì)胞系XPTS-1［7］細(xì)胞周期分布和凋亡率的變化及活化的Akt(p-Akt)、Bcl-xL表達(dá)，初步探討p-Akt及Bcl-xL蛋白在嬰幼兒血管瘤中的表達(dá)及意義。

1　材料與方法

1.1主要材料及試劑胎牛血清購(gòu)于杭州四季青生物工程材料有限公司，DMEM培養(yǎng)基和RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)GIBCO公司，胰蛋白酶購(gòu)于華美生物工程有限公司，DMSO購(gòu)于天津永大化學(xué)試劑開發(fā)中心，LY294002購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，兔抗人p-Akt多克隆抗體購(gòu)于美國(guó)NEOMARKERS公司，兔抗人Bcl-xL多克隆抗體購(gòu)于美國(guó)NEOMARKERS公司，流式細(xì)胞儀試劑盒購(gòu)于北京四正柏生物科技有限公司。

1.2嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定及分組采用組織塊加酶消化法培養(yǎng)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞。去除新鮮血管瘤標(biāo)本上殘留的皮膚和脂肪組織，將瘤體剪成1～2 cm3的組織塊，0.25%胰蛋白酶37℃消化10～20min，將消化后的組織塊修剪成1mm3大小，接種于無菌培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入3mL含20%胎牛血清、70 μg/L VEGF、100mg/L肝素的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，4～5d后更換培養(yǎng)液。待組織塊周圍爬出內(nèi)皮細(xì)胞較多時(shí)去除組織塊，更換培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞鋪滿瓶底后1∶2傳代培養(yǎng)。傳至16代時(shí)，換用RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，建立嬰幼兒血管瘤XPTS-1細(xì)胞系［7］。細(xì)胞鑒定采用免疫組化法對(duì)Ⅷ因子相關(guān)抗原進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞Ⅷ因子表達(dá)陽(yáng)性。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的XPTS-1細(xì)胞，分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組。

1.3細(xì)胞周期檢測(cè)取培養(yǎng)的已傳代并貼壁的細(xì)胞，先用血清饑餓24 h，使細(xì)胞生長(zhǎng)周期同步化;對(duì)照組XPTS-1細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組參照文獻(xiàn)［8］加入50 μmol/L LY294002處理，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，PBS洗2次，加入碘化丙啶(PI)，避光，4℃作用30min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.4細(xì)胞凋亡率測(cè)算將LY294002處理24 h后的2組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，分別取1mL，PBS洗滌2次，棄上清，加入預(yù)冷的結(jié)合緩沖液100 μL重懸細(xì)胞，加入AnnexinV-FITC 5 μL和PI(20g/L)10 μL，混勻后于室溫避光孵育15min，在反應(yīng)管中加入400 μL結(jié)合緩沖液，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。

1.5 p-Akt和Bcl-xL表達(dá)檢測(cè)將LY294002處理24 h后的兩組細(xì)胞吸出培養(yǎng)液，PBS洗滌后每孔加入細(xì)胞裂解液50 μL提取總蛋白。以牛血清蛋白做標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)蛋白濃度。取50 μg總蛋白經(jīng)10%聚丙烯酞胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶(含0.1% Tween20)封閉1 h，加一抗(p-Akt 1∶1 000; Bcl-xL 1∶1 000)，室溫孵育過夜，洗膜，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，洗膜，ECL顯色，暗室中曝光，顯影，定影，保存膠片，掃描分析p-Akt和Bcl-xL表達(dá)情況。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以珋x±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1兩組細(xì)胞周期分布比較G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加(P＜0.01)，S期和G2/M期細(xì)胞明顯減少(P＜0.05)，細(xì)胞生長(zhǎng)被阻滯于G0/G1期，見表1。

表1　兩組處理24 h后XPTS-1細(xì)胞周期分布(%，)

表1　兩組處理24 h后XPTS-1細(xì)胞周期分布(%，)

注:與對(duì)照組比較，△P＜0.05，*P＜0.01。

組別　各期細(xì)胞比例G0/G1期　S期　G2/M期實(shí)驗(yàn)組78.63±5.26　19.51±2.82　1.60±0.74對(duì)照組　61.89±3.28*　32.75±2.17*　5.07±1.19△

2.2兩組細(xì)胞凋亡率比較對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率分別為(0.27±0.14)%、(34.72± 0.51)%，兩組比較，P＜0.01。

2.3兩組p-Akt和Bcl-xL表達(dá)比較對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中p-Akt的表達(dá)強(qiáng)度分別為0.97±0.22、0.21 ±0.07，Bcl-xL的表達(dá)強(qiáng)度分別為0.59±0.11、0.12 ±0.03，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組兩種蛋白表達(dá)強(qiáng)度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.01)。

3　討論

IH是嬰兒期常見的良性腫瘤，其特點(diǎn)為異常血管的迅速增長(zhǎng)。直至目前其增生和退化的細(xì)胞及分子機(jī)制尚未完全闡明。目前IH的治療方法主要有口服或局部注射糖皮質(zhì)激素、放療、激光［9］、口服α-干擾素、硬化劑局部注射［10］及手術(shù)等，但均有不同程度不良反應(yīng)，尋求新的治療方法成為目前研究的熱點(diǎn)。

Akt又名蛋白激酶B，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，位于PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路的中心環(huán)節(jié)，Akt的活化依賴PI3K對(duì)磷脂酰肌醇環(huán)上3位羥基的特異磷酸化，p-Akt通過磷酸化下游的靶蛋白發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、化療耐受等作用［11］。

p-Akt能調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G1/S時(shí)相轉(zhuǎn)換，其機(jī)制是通過使失活，增加cyclin-D1轉(zhuǎn)錄，磷酸化p21、p27等實(shí)現(xiàn)［12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路后G0/G1期細(xì)胞比例比對(duì)照組明顯增加，p-Akt表達(dá)明顯降低，表明通路阻斷后，活化的Akt減少，調(diào)節(jié)細(xì)胞G1/S期的作用不能發(fā)揮，細(xì)胞被阻滯于G0/G1期。

Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，其成員包括抗凋亡因子和促凋亡因子，調(diào)節(jié)多細(xì)胞機(jī)體的發(fā)展及組織的動(dòng)態(tài)平衡［13］。Bcl-x是Bcl-2家族的成員，是1993年Boise等［14］以鼠Bcl-2 的cDNA為探針從雞淋巴細(xì)胞cDNA文庫(kù)中篩選到的一個(gè)克隆，激活后有雙重調(diào)節(jié)作用，因其mRNA的第一個(gè)外顯子5'端剪接位點(diǎn)不同而存在兩種大小不同的片段，即表達(dá)長(zhǎng)片段的Bcl-xL及短片段的Bcl-xS，Bcl-xL在細(xì)胞質(zhì)中通過與Bax形成異源二聚體抑制細(xì)胞凋亡。近年來，Bcl-xL在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用受到較多關(guān)注，如前列腺癌［15］、肺癌［16］等。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路后，XPTS-1細(xì)胞的凋亡率明顯增加，p-Akt和Bcl-xL表達(dá)均降低。表明PI3K/Akt信號(hào)通路與IH細(xì)胞的增生、凋亡可能存在某種關(guān)系，且抗凋亡因子Bcl-xL亦在其中發(fā)揮重要作用。根據(jù)國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果提示，p-Akt可能是通過磷酸化NF-κB，激活其轉(zhuǎn)錄功能，促進(jìn)Bcl-xL表達(dá)［17］，一旦p-Akt的活性被抑制，Bcl-xL表達(dá)亦會(huì)下降，從而其抗凋亡作用受到抑制。

綜上所述，PI3K/Akt信號(hào)通路及其下游的BclxL在嬰幼兒血管瘤細(xì)胞的凋亡中發(fā)揮重要作用，據(jù)此推測(cè)嬰幼兒血管瘤的增生、消退很可能與PI3K/ Akt通路的激活與抑制及Bcl-xL的表達(dá)高低有關(guān)系。本研究為以PI3K/Akt信號(hào)通路為靶點(diǎn)的治療方法提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，亦為今后嬰幼兒血管瘤增生、消退機(jī)制更進(jìn)一步的研究提供了新思路，但細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路錯(cuò)綜復(fù)雜，涉及因子很多，嬰幼兒血管瘤的發(fā)病機(jī)制仍需更深入地研究去完善。

參考文獻(xiàn):

［1］Jinninm，Ishihara T，Boye E，et al.Recent progress in studies of infantile hemangioma［J］.Jdermatol，2010，37(4): 283-298.

［2］Boye E，Olsen BR.Signalingmechanisms in infantile hemangioma ［J］.Curr Opin Hematol，2009，16(3): 202-208.

［3］Wu B，Wang X，Chi ZF，et al.Ursolic acid-induced apoptosis in K562 cells involving upregulation of PTEN gene expression and inactivation of the PI3K/Akt pathway［J］.Arch Pharm Res，2012， 35(3): 543-548.

［4］Jiang BH，Zheng JZ，Aokim，et al.Phosphatidylinositol 3-kinase signalingmediates angiogenesis and expression of vascular endothelial growth factor in endothelial cells［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97(4): 1749-1753.

［5］Fernandez-Flores A，Valerdiz S.Study of the immuno expression of Bcl-2 by a cutaneous granular cell tumor［J］.Actadermatovenerol Alp Panonica Adriat，2010，19(3): 11-18.

［6］Boise LH，Minn AJ，Noel PJ，et al.CD28costimulation can promote T cell survival by enhancing the expression of Bcl-xL［J］.J Immunol，2010，185(7): 3788-3799.

［7］Li P，Xiao XE，Xu Q，et al.Establishment of human infancy hemangioma-derived endothelial cell line XPTS-1 and animalmodel of human infancy hemangioma［J］.Zhonghua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi，2011，46(3): 129-133.

［8］石丹，范德生，甄蕾，等，PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑在舌鱗癌細(xì)胞系增殖和凋亡中的作用［J］.口腔頜面外科雜志，2010，20(5): 324-326.

［9］Yan X，Zhou J.The application progress of treat of oral andmaxillofacial cancer by laser［J］.Stomatolmed Sci，2006，26(6): 2246-2469.

［10］Yang YW，SunmY，Shang LF，et al.Contral treatment with smalldose of PYM treat infantile parotid gland area hemangioma［J］.Stomatolmed Sci，2008，28(2): 75-77.

［11］Martelli AM，Evangelisti C，Chiarini F，et al.The phosphatidylinositol 3-kinase/Akt/mTOR signaling network as a therapeutic target in acutemyelogenous leukemia patients［J］.Oncotarget，2010，1(2): 89-103.

［12］沈磊，楊鳴良，孫長(zhǎng)伏.LY294002對(duì)唾液腺腺樣囊性癌SACC-83細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響［J］.中國(guó)口腔頜面外科雜志，2006，4(2): 132-135.

［13］VauxdL，Korsmeyer SJ.Celldeath indevelopment［J］.Cell，1999，96(2): 245-254.

［14］Boise LH，González-Garcíam，Postema CE，et al.Bcl-x，a bcl-2 related gene that functions as adominant regulator of apoptotic celldeath［J］.Cell，1993，74(4): 597-608.

［15］Hwang JJ，Kim YS，Kim T，et al.A novel histonedeacetylase inhibitor，CG200745，potentiates anticancer effect ofdocetaxel in prostate cancer viadecreasingmcl-1 and Bcl-xL［J］.Invest Newdrugs，2012，30(4): 1434-1442.

［16］Li X，Wang J，Chen XJ，et al.Effect of chitooligosaccharides on cyclind1，bcl-xl and bcl-2mRNA expression in A549 cells using quantitative PCR［J］.Chinese Science Bulletin，2011，56(15): 1629-1632.

［17］Go HS，Seo JE，Kim KC，et al.Valproic acid inhibits neural progenitor celldeath by activation of NF-κB signaling pathway and upregulation of Bcl-xL［J］.J Biomed Sci，2011，18(1): 48.

收稿日期:( 2015-04-10)

文章編號(hào):1002-266X(2015)33-0027-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):R732.2