劉玥，侯辰，唐鵬，陳麗，張欣，種莉，劉鵬，李銳，趙性泉，李曉青，3

抗血小板藥物能夠有效預防缺血性卒中的發(fā)病及復發(fā)現(xiàn)已得到多項循證醫(yī)學的證據(jù)。阿司匹林和氯吡格雷是國內(nèi)外缺血性腦血管病二級預防指南推薦使用的一線抗血小板藥物，對于卒中高危患者卒中復發(fā)的預防，氯吡格雷較阿司匹林具有更多優(yōu)勢，但也有很多研究表明，氯吡格雷的抗血小板效應存在個體差異，CYP2C19的基因型是最重要的因素之一。CYP2C19的基因型為氯吡格雷慢代謝基因型者存在氯吡格雷抗血小板效應減弱，可能具有潛在缺血性卒中復發(fā)風險，因而根據(jù)患者對抗血小板藥物的反應差異個體化選擇抗血小板藥物得到越來越多的關注。

本研究對缺血性卒中患者應用抗血小板聚集藥物治療過程中，評估患者危險分層，選擇抗血小板藥物，應用血栓彈力圖對血小板聚集抑制率進行檢測，并對應用氯吡格雷患者進行CYP2C19基因多態(tài)性檢測，從而指導抗血小板藥物選擇，并對終點事件（卒中、急性冠狀動脈綜合征、出血和死亡）進行統(tǒng)計，以評估個體化抗血小板藥物的療效。

1 對象與方法

1.1 研究對象

1.1.1 納入陜西省人民醫(yī)院2013年9月-2014年5月首次發(fā)作非心源性缺血性卒中患者 納入標準：①連續(xù)登記陜西省人民醫(yī)院2013年9月-2014年9月住院期間首次發(fā)作急性缺血性卒中（發(fā)病2周內(nèi)），診斷標準符合2010中國急性缺血性腦卒中診治指南[1]；②動脈狹窄的病因考慮為中國缺血性卒中分型診斷（China Ischemic Stroke Subclassification，CISS）為大動脈粥樣硬化型[2]；③年齡45～80歲。

排除標準：①曾經(jīng)被診斷癥狀性缺血性腦卒中，包括短暫性腦缺血發(fā)作（transient ischemic attack，TIA）或腦梗死并經(jīng)計算機斷層掃描（computerized tomography，CT）或磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）證實；②存在其他嚴重疾病狀態(tài)的患者（包括活動期癌癥或顯著肝腎功能不全或酒精或非法藥品濫用）；③心源性栓塞及非動脈粥樣硬化性血管狹窄患者，包括各種血管炎、血管痙攣、夾層動脈瘤或煙霧?。虎芡瑐阮i內(nèi)動脈曾行內(nèi)膜剝脫術或支架治療、存在腦血管畸形或動靜脈瘺的患者；⑤不能配合研究的患者。

1.1.2 應用SPSS軟件進行隨機分組，按確診的順序根據(jù)隨機表分配組別，將納入患者分為個體化治療組與常規(guī)治療組。對個體治療組患者應用Essen卒中風險評分量表（Essen Stroke Risk Score，ESRS）進行危險度分層，對評分小于3分的低?；颊呓o予阿司匹林抗血小板聚集治療，對評分大于等于3分的高?；颊呓o予氯比格雷抗血小板聚集治療。常規(guī)治療組給予阿司匹林抗血小板治療。

1.1.3 在服藥7 d后應用血栓彈力圖評價患者花生四烯酸（arachidonic acid，AA）/二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）誘導的血小板聚集抑制率，并檢測其CYP2C19基因型。將阿司匹林和氯吡格雷治療后血小板AA途徑抑制率或ADP途徑抑制率≥75%為效果良好，50%～75%為有效，＜50%為效果欠佳稱為阿司匹林實驗室抵抗（aspirin resistance，AR）或氯吡格雷實驗室抵抗（clopidogrel resistance，CR）。如不存在阿司匹林實驗室抵抗、氯比格雷實驗室抵抗，繼續(xù)之前治療。如存在阿司匹林實驗室抵抗，長期給予氯比格雷抗血小板聚集治療；如存在氯比格雷實驗室抵抗，CYP2C19基因型非快代謝者，長期給予阿司匹林抗血小板聚集治療；如存在氯比格雷實驗室抵抗，CYP2C19基因型為快代謝者，去除影響血小板ADP途徑抑制率降低的原因（聯(lián)合用藥影響、服藥依從性差等）后，長期給予氯吡格雷抗血小板聚集治療。統(tǒng)計血栓彈力圖檢測與CYP2C19基因多態(tài)性檢測是否存在相關性，以評價血栓彈力圖檢測的穩(wěn)定性。觀察1年內(nèi)終點事件發(fā)生情況，統(tǒng)計個體化治療組與常規(guī)治療組終點事件發(fā)生率是否存在差異。

終點事件包括：卒中（急性腦梗死/TIA）[1]、急性冠狀動脈綜合征[3]、出血[2011年出血學術研究會（bleeding academic research consortium，BARC）制定的心血管臨床研究中出血的標準定義2型及3型][4]及死亡。

1.2 方法

1.2.1 血小板聚集抑制率檢測方法 使用美國Haemoscope公司5000型血栓彈力圖（thromboela stogram，TEG）凝血分析儀，試劑包括高嶺土（含1%Kadin液）、激活劑、ADP和AA。所有患者應用氯吡格雷14 d晨起時空腹抽取靜脈血，置于含3.13%枸櫞酸鈉和肝素鉀的采血管內(nèi)，2 h內(nèi)應用TEG凝血分析儀進行檢查。由血栓彈力圖軟件計算出AA、ADP誘導的血小板聚集抑制率。

氯吡格雷基因多態(tài)性檢測方法：使用上海Baio（R）BE-2.0生物芯片識讀儀。利用基因芯片試劑盒檢測原理。根據(jù)說明書提取外周血中的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），與固定有基因探針的基因芯片進行特異性雜交，經(jīng)過酶促顯色反應，測定出患者基因中的單核苷酸（single nucleotide polymorphism，SNP）信息，確定基因型。本實驗中檢測的基因型包括CYP2C19*1/*1（636 G G，6 81G G），C Y P2C19*1/*2（636GG，681GA，CYP2C19*1/*3（636GA，6 81G G），C Y P2C19*2/*2（636 G G，681AA），CYP2C19*2/*3（636GA，681GA），CYP2C19*3/*3（636AA，681GG）。

1.2.2 判定標準 根據(jù)患者CYP2C19基因多態(tài)性，將其分為快代謝基因型（無位點突變）CYP2C19*1/*1（636GG，681GG），中代謝基因型（1個基因位點突變），CYP2C19*1/*2（636GG，681GA），CYP2C19*1/*3（636GA，681GG），慢代謝基因型（1個基因位點突變）CYP2C19*2/*2（636GG，681AA），CYP2C19*2/*3（636GA，681GA），CYP2C19*3/*3（636AA，681GG）。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 10.0軟件，組間計數(shù)資料的比較采用卡方檢驗，計量資料的比較采用t檢驗，雙側漸進概率P值＜0.05定義為差異具有顯著性。

2 結果

本研究納入患者210例，失訪3例，共隨訪207例。其中患者年齡46～80歲。兩組患者間人口學及病史特征（性別、年齡、是否患有糖尿病、高血壓、是否吸煙、是否有經(jīng)皮冠狀動脈介入治療、慢性阻塞性肺疾病及6個月內(nèi)心肌梗死病史）差異無顯著性。兩組患者責任血管狹窄率分組＜50%為無狹窄/輕度狹窄，50%～70%為中度狹窄，＞70%為重度狹窄，比較個體化治療及常規(guī)治療組患者間責任血管狹窄程度差別，不同程度血管狹窄的組間差異無顯著性。

個體化組Essen評分大于等于3分者（46例）應用氯吡格雷，對其進行基因檢測，根據(jù)氯吡格雷基因型分為：無位點突變20例，1個位點突變20例，2個位點突變6例。無位點突變基因型、1個位點突變基因型患者應用氯吡格雷的血小板抑制率明顯高于2個位點突變型，結果差異有顯著性（P=0.018，P=0.015）。

抗血小板藥物反應多樣性與人口學及病史特征差別（表1），組間差異無顯著性。TEG檢測的血小板抑制率（platelet aggregation inhibition rate，PAI）≥50%為敏感，＜50%為抵抗，抗血小板藥物敏感組與抵抗組PAI如表1。個體化治療組阿司匹林抵抗者19例，抗血小板藥物更換為氯吡格雷。

根據(jù)CYP2C19基因型將應用氯吡格雷者分為無位點突變、1個位點突變及2個位點突變3組，根據(jù)TEG所測得的PAI≥50%分為氯吡格雷敏感，PAI＜50%分為氯吡格雷抵抗。氯吡格雷敏感組與抵抗組相比，其基因型差異有顯著性（P=0.006）。排除了合并應用質子泵抑制劑（proton pump inhibitors，PPI）等因素，TEG抵抗的14例中11例更換了抗血小板藥物。

觀察個體化治療組與常規(guī)治療組1年內(nèi)臨床終點事件發(fā)生率，包括卒中、心肌梗死、死亡和出血等終點事件的發(fā)生率。發(fā)現(xiàn)兩組間終點事件發(fā)生率差異無顯著性。根據(jù)是否發(fā)生臨床終點事件將患者分組，觀察患者的人口學及病史特征與終點事件發(fā)生率關系。結果顯示1例近6個月內(nèi)曾發(fā)生心肌梗死的患者，在此次研究隨訪中發(fā)生缺血性卒中，與未發(fā)生終點事件組相比差異有顯著性。余人口學及病史特征，與是否發(fā)生終點事件兩組間差異均無顯著性（表2）。

本研究分析了氯吡格雷反應多樣性與合并用藥的關系。應用氯吡格雷的46例患者，TEG敏感的32例中合并使用PPI 19例，合并使用他汀類藥物31例；TEG抵抗的14例中合并使用PPI 9例，合并使用他汀類藥物14例。統(tǒng)計表明是否合并PPI或他汀類藥物，與氯吡格雷是否發(fā)生抵抗差異均無顯著性。

3 討論

卒中是發(fā)病率高、死亡率高及致殘率高的疾病，已成為全球第三位的死亡原因。抗血小板藥物可以有效預防缺血性卒中的發(fā)病及復發(fā)，但是臨床中仍有部分患者存在對抗血小板藥物療效減退，出現(xiàn)缺血性卒中復發(fā)，即抗血小板藥物抵抗現(xiàn)象?？寡“逅幬锏牡挚宫F(xiàn)象是當前的研究熱點，但在缺血性卒中治療中，對于抗血小板藥物抵抗所致的卒中復發(fā)缺乏有效的對策。血栓彈力圖對于抗血小板藥物在缺血性卒中治療中的選擇具有一定的指導意義，但該檢測方法是否穩(wěn)定，能否通過血栓彈力圖指導下的抗血小板藥物選擇降低缺血性卒中復發(fā)，目前仍缺少臨床證據(jù)。

表1 抗血小板藥物反應多樣性與臨床特征關系

研究表明，CYP2C19基因多態(tài)性是產(chǎn)生氯吡格雷反應個體差異的重要因素。CYP2C19存在多種突變等位基因，CYP2C19*2和CYP2C19*3為最主要的突變形式。這兩種突變等位基因均能造成CYP2C19酶活性的降低或完全喪失，從而對氯吡格雷的療效產(chǎn)生重要的影響[5]。2010年3月美國FDA發(fā)布警告，要求氯吡格雷說明書中附加最高警示級別的“黑框標簽”，建議患者在使用氯吡格雷之前進行CYP2C19基因型檢測，使醫(yī)師了解患者氯吡格雷的代謝能力，以便于調(diào)整患者的給藥劑量[6]。

表2 患者特征與是否發(fā)生臨床終點事件關系

本研究選取CYP2C19*2和CYP2C19*3這2個等位基因，在東亞人中可解釋超過99%的弱代謝表型[7-8]。這部分人群再發(fā)心血管事件比無此基因攜帶者再發(fā)心血管事件多3.58倍[9]，氯吡格雷聯(lián)合阿司匹林與阿司匹林單獨治療急性非致殘性腦血管事件高危人群研究（Colopidogrel in High-risk Patients with Acute Non-disabling Cerebrovascular Events，CHANCE）-藥物基因亞組研究發(fā)現(xiàn)，中國人CYP2C19基因慢代謝型和中間代謝型比例高達53.2%，比美國的28%～33%要高得多[10]。本研究中CYP2C19基因型1個位點突變（中間代謝型）與2個位點突變（慢代謝型）比例達56.6%，與CHANCE研究相吻合，故氯吡格雷在中國人中的應用不能照搬國外研究結果。但中間代謝型并不影響氯吡格雷的血小板抑制率，因此氯吡格雷基因檢測與血栓彈力圖仍具有一定的判斷抗血小板作用的價值。

本研究在缺血性卒中患者應用抗血小板聚集藥物治療過程中，應用血栓彈力圖對血小板聚集抑制率進行檢測，并對氯吡格雷基因多態(tài)性進行檢測，發(fā)現(xiàn)氯吡格雷基因快代謝與中代謝基因型患者應用氯吡格雷后均可達到較好的血小板抑制效果，發(fā)生氯吡格雷抵抗現(xiàn)象概率較低。

他汀類藥物因其調(diào)脂、抗炎和穩(wěn)定斑塊等作用，在缺血性卒中的二級預防中起到重要作用。有研究表明通過細胞色素P4503A4代謝的他汀可能會降低氯吡格雷對血小板的抑制作用，是氯吡格雷抵抗的潛在因素之一。但目前的大型臨床統(tǒng)計試驗傾向于他汀類不影響氯吡格雷的抗血小板療效[11-12]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)合用他汀類藥物對氯吡格雷反應性的影響差異無顯著性。

長期吸煙是冠心病患者經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）術后發(fā)生氯吡格雷抵抗的獨立危險因素[13]。本研究中，氯吡格雷抵抗組14例，其中吸煙者4例，敏感組32例，其中吸煙者7例。兩組間差異無顯著性，可能由于入組患者例數(shù)較少，在以后進一步研究中可以擴大樣本數(shù)量進行進一步研究。

有1例6個月內(nèi)曾發(fā)生心肌梗死患者（未溶栓，未進行PCI治療）在此次研究中分在常規(guī)治療組，且在觀察期間發(fā)生終點事件，因本研究中6個月內(nèi)心肌梗死人數(shù)少，無法從本研究中判斷發(fā)生終點事件是否與心肌梗死或治療方式選擇有關。美國的一項研究顯示，急性心肌梗死發(fā)病后30 d內(nèi)卒中的平均發(fā)病率為22.6/1000，是正常人群的44倍之多；3年內(nèi)仍為正常人群的2～3倍，3年后才降至正常人群水平[14]，而該人群卒中事件高發(fā)與選用何種抗血小板藥物治療是否有關未見報道。

常規(guī)應用阿司匹林組，與應用危險分層聯(lián)合氯吡格雷基因、血栓彈力圖檢測的個體化治療組相比，兩組間終點事件差異無顯著性。提示血栓彈力圖評估抗血小板藥物療效可能無明確臨床意義，但由于種族和地區(qū)差異，可能導致臨床終點事件發(fā)生率存在差別。但根據(jù)本研究，個體化治療組有26.8%患者更換了初始治療方案。國外一項研究[15]納入324例患者，其中73例（22.5%）有過抗血小板方案的調(diào)整。進行了抗血小板方案調(diào)整的患者較未進行過調(diào)整的患者繼發(fā)死亡、出血或缺血性事件的發(fā)生率明顯更高（40%vs21%）。本研究中對于更換治療方案者數(shù)量較小，對于研究結果的影響難以得出有意義的統(tǒng)計學結果，在進一步的研究中，我們將針對更換治療方案者與常規(guī)治療組進行對照，統(tǒng)計對于終點事件發(fā)生率影響。

一直以來，因為缺乏足夠證據(jù)支持雙聯(lián)抗血小板聚集治療可以增加獲益。直至CHANCE研究[9]結果發(fā)布后，2014年美國心臟協(xié)會（American Heart Association，AHA）/美國卒中協(xié)會（American Stroke Association，ASA）發(fā)布了最新的卒中和TIA的二級預防指南[16]更新的部分才提出缺血性小卒中或TIA后24 h內(nèi)，可考慮開始氯吡格雷與阿司匹林聯(lián)合治療。在本研究設計開始時CHANCE研究[9]、《2014年AHA/ASA卒中和TIA的二級預防指南》[16]及《中國缺血性腦卒中和短暫性腦缺血發(fā)作二級預防指南2014》[17]尚未發(fā)布，因此本研究對于小卒中及伴有顱內(nèi)外動脈重度狹窄的患者未進行阿司匹林+氯吡格雷雙聯(lián)抗血小板聚集治療。本研究為單中心隨機對照研究，不可避免存在選擇偏倚及信息偏倚等因素，且統(tǒng)計患者人數(shù)較少。在進一步的研究中，我們將擴大樣本量，延長隨訪時間，并對于雙聯(lián)抗血小板治療對于終點事件影響也將納入研究分組中，以期得到更有意義的臨床結果。

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