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(甘肅中醫(yī)學(xué)院， 蘭州 730000)

甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)是中醫(yī)最常用的藥物之一，有“十方九草”之稱。為豆科多年生草本植物，干燥根入藥，具有補(bǔ)脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調(diào)和諸藥之功效[1]。我國甘草人工栽培面積較大，但栽培所用甘草種子基本來自于野生，種源混雜，種子調(diào)撥混亂，所產(chǎn)藥材質(zhì)量良莠不齊[2-3]，急需對市場流通用種質(zhì)量進(jìn)行規(guī)范。種子檢驗(yàn)是保證種子質(zhì)量的重要措施，統(tǒng)一、標(biāo)準(zhǔn)的檢驗(yàn)方法及程序是保證檢驗(yàn)公證性和可靠性的前提。采用電泳分離的蛋白圖譜檢測農(nóng)作物種子純度已有報(bào)道。利用種子蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)圖譜鑒定種子純度具有不需將種子萌發(fā)、送檢樣品可及時(shí)進(jìn)行分析、電泳后的染色步驟相對簡單等優(yōu)點(diǎn)，因而利用電泳圖譜鑒定甘草種子純度的方法值得探討。本試驗(yàn)以甘草種子為材料，對其蛋白質(zhì)的提取方法及電泳條件進(jìn)行研究，建立適宜于甘草種子蛋白質(zhì)提取和鑒定的技術(shù)體系，為甘草的品種純度檢測提供參考和依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材 料

試驗(yàn)材料為烏拉爾甘草種子(GlycyrrhizauralensisFisch.)，蛋白質(zhì)提取前將其種子用微型粉碎機(jī)打磨成粉末，置于4 ℃冰箱中備用。

1.2 試 劑

三羥甲基氨基甲烷(Tris)，丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺，尿素，二硫蘇糖醇(DTT)，乙二胺四乙酸(EDTA)，丙酮，考馬斯亮藍(lán)，十二烷基硫酸鈉(SDS)，甘油。

1.3 儀 器

試驗(yàn)儀器為超聲波清洗儀(BX 7200 HP)、冰凍離心機(jī)(TGL 16 M)、小型電泳儀(DYCZ-23 A型)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DGG-9620 A)、冰箱(海爾BCD 216 YH)。

2 方 法

2.1 蛋白質(zhì)提取方法

2.1.1 濃縮膠緩沖液提取法[4]

稱取甘草種子粉末0.1 g，加稀釋4倍的濃縮膠緩沖液(pH=6.7)1 mL冰浴研磨(樣品∶提取液：m∶v=1∶10，下同)。超聲震蕩30 min，3 500 r/min離心30 min，取上清液，加入等體積40%的蔗糖，4 ℃冰箱儲藏備用，編號1。

2.1.2 鹽溶蛋白提取法[5]

稱取種子粉末0.1 g，加入1.5 mol/L的氯化鈉鹽溶液1 mL，在冰浴條件下研磨，3 500 r/min離心20 min，取上清液，4 ℃冰箱中儲藏備用，編號2。

2.1.3 電極緩沖液提取法[5]

稱取種子0.1 g，加入提取液(40%的蔗糖10 mL，電極緩沖液2 mL，加水8 mL混勻)1 mL在冰浴條件下研磨，3 500 r/min離心20 min，取上清液，4 ℃冰箱儲藏備用，編號3。

2.1.4 DTT·Tris法[4]

將種子用pH=8.0的50 mmol/L的Tris-HCl(含1.5%DTT和0.6 mol/L的EDTA)緩沖液在4 ℃浸泡提取1 h，10 000 r/min離心20 min，離心2次，編號4。

2.1.5 尿素法[6]

將種子冷藏30 min后粉碎，然后裝入離心管中，加入蛋白質(zhì)提取液(32.43 g尿素，120μL乙二醇溶于1 000 mL雙蒸水)1 mL，室溫下提取1 h后，置于漩渦混合器混勻約1 min，再在4 ℃ 10 000 r/min離心10 min，取上清液備用，編號5。

2.1.6 Tris法[4]

稱取樣品0.1 g，加入pH=8.0的0.15 mol/L的Tris-HCl緩沖液，將蛋白質(zhì)樣品與樣品緩沖液等體積混勻，4 ℃浸泡6 h，4 000 r/min離心15 min，取上清液備用，編號6。

2.1.7 巰基乙醇·Tris 法[6]

pH=8.0的50 mmol/L的Tris-HCl(含1%SDS，1%巰基乙醇，40%的蔗糖)緩沖液，將蛋白質(zhì)樣品與2倍的樣品緩沖液按體積比混勻，于沸水或微量恒溫器(100 ℃)中加熱3 min，馬上插入冰上冷卻備用，編號7。

2.1.8 丙酮沉淀法[4]

稱取樣品粉末0.1 g，加入1 mL的樣品提取液(pH=8.0的62.5 mmol/L的Tris-HCl，0.5%SDS，10%甘油，5%巰基乙醇)，渦旋30 s，4 ℃放置1 h，樣品搖勻后，4 ℃條件下12 000 r/min離心20 min，上清液轉(zhuǎn)移至3 mL離心管中加入1 mL預(yù)冷丙酮，搖勻，-20 ℃放置1 h沉降蛋白質(zhì)，4 ℃，5 000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀在-20 ℃放置1 h，使丙酮充分揮發(fā)，沉淀備用，編號8。

2.2 甘草種子蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳

2.2.1 分離膠和濃縮膠的配制

表1 分離膠溶液配方(單位：mL)

試劑濃度8%10%12% 蒸餾水4．23．52．9 30%Acry/Bis2．73．44 分離膠緩沖液2．52．52．5 50%甘油0．60．60．6 10%SDS0．10．10．1 10%APS0．10．10．1 TEMED0．010．010．01

表2 濃縮膠溶液配方

蒸餾水30%Acry/Bis濃縮膠緩沖液10%SDS10%APSTEMED2．7mL0．67mL0．5mL50μL50μL4μL

2.2.2 SDS-PAGE凝膠點(diǎn)樣與電泳

按配方配制好凝膠(見表1和表2)，采用以上8種方法提取種子蛋白質(zhì)，吸取樣品點(diǎn)樣，在電泳槽中加電極緩沖液(將3.03 g Tris、14.4 g甘氨酸、1.0 g SDS溶入900 mL超純水中，定容至1 000 mL即為電極緩沖液)，并在緩沖液中加入3～4滴溴酚藍(lán)指示劑，接上電泳儀，打開開關(guān)，起始電壓60 V電泳，待溴酚藍(lán)指示帶移至分離膠時(shí)電壓改為120 V繼續(xù)電泳，待溴酚藍(lán)指示帶移至下端1～1.5 cm時(shí)關(guān)上電源停止電泳。

2.2.3 染色與脫色

將膠片取下，置于染色液(0.25 g考馬斯亮藍(lán)G-250，7 mL甲醇，7 mL冰醋酸，126 mL超純水)中染色1 h，然后放入脫色液(66.7 mL甲醇，7 mL冰醋酸，126 mL超純水)脫色，直至膠片背景藍(lán)色完全透明狀，拍照。

2.3 分離膠濃度試驗(yàn)

分別采用10%和12%的分離膠進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳。

2.4 料液比試驗(yàn)

采用巰基乙醇法提取蛋白質(zhì)，設(shè)料液比1∶10，2∶10，3∶10，1∶15，1∶20和1∶25，確定適宜的料液比。

2.5 種質(zhì)鑒定試驗(yàn)

烏拉爾甘草與脹果甘草的蛋白質(zhì)電泳結(jié)果比較。

3 結(jié)果與分析

3.1 蛋白質(zhì)不同提取方法的結(jié)果比較

8種方法提取甘草種子的蛋白質(zhì)電泳結(jié)果如圖1所示，點(diǎn)樣順序依次為蛋白質(zhì)對照品，濃縮膠提取法，鹽溶液提取法，電極緩沖液提取法，DTT·Tris法，尿素法，巰基乙醇·Tris法，Tris法和丙酮沉淀法。8種提取方法所得的PAGE圖像中有多條共有帶，但不同方法在某些條帶的有無，強(qiáng)弱等方面有差異。巰基乙醇·Tris法和丙酮沉淀法電泳效果最好，前者得到12條帶，后者得到9條蛋白質(zhì)條帶，且背景顏色較淺，適宜于條帶的對比分析。濃縮膠提取法無明顯可見條帶，說明該法提取的蛋白質(zhì)量太少。鹽溶蛋白法清晰條帶數(shù)少，條帶明顯展寬，但背景清晰。電極緩沖液提取法和DTT法條帶數(shù)量多，但條帶不清晰，其原因是這2種方法提取的蛋白質(zhì)量太少。尿素法和Tris法泳道染色濃重，條帶分辨不清，其原因可能是該方法提取的蛋白質(zhì)純度不同。因此，巰基乙醇·Tris法和丙酮沉淀法是甘草種子蛋白質(zhì)提取的適宜方法。

3.2 不同濃度分離膠的蛋白質(zhì)電泳結(jié)果比較

不同的分離膠濃度電泳結(jié)果表明(見圖1和圖2)，濃縮膠提取法，鹽溶蛋白提取法，電極緩沖液提取法和DTT·Tris法在10%和12%的分離膠濃度電泳時(shí)效果差異不大，電泳效果均不理想。巰基乙醇·Tris法電泳結(jié)果顯示，條帶數(shù)目多且清晰，與10%分離膠電泳效果無顯著差異，只是最下端2條帶分離得更清晰，說明高濃度的分離膠更有利于小分子蛋白質(zhì)的分離。丙酮沉淀法幾乎無條帶，其原因可能是該法提取的蛋白質(zhì)在4 ℃放置2 d后降解了，蛋白質(zhì)含量測定的結(jié)果也證明了這一點(diǎn)。因此，選擇巰基乙醇·Tris進(jìn)行料液比和種質(zhì)鑒定試驗(yàn)。

(點(diǎn)樣順序依次為蛋白質(zhì)對照品,樣品1～8)。下同。

圖2 蛋白質(zhì)電泳不同分離膠濃度的比較(12%分離膠)

3.3 不同料液比的蛋白質(zhì)電泳結(jié)果比較

巰基乙醇·Tris法不同料液比提取烏拉爾甘草種子蛋白質(zhì)的電泳結(jié)果如圖3所示，點(diǎn)樣順序依次為料液比1∶10，2∶10，3∶10，蛋白質(zhì)對照品，1∶15，1∶20和1∶25，不同料液比的烏拉爾甘草種子蛋白質(zhì)樣品各連點(diǎn)2個(gè)孔)。在提取液體積不變的情況下，增加甘草種子的量對蛋白質(zhì)電泳的結(jié)果影響不大，然而在甘草種子的量不變的情況下增加提取液的體積，條帶均很淺淡，說明1∶10的料液比中，種子即料的量適宜，提取液的量很充足。綜上所述，提取烏拉爾甘草的蛋白質(zhì)時(shí)，料液比在1∶10和2∶10時(shí)均適宜于甘草種子蛋白質(zhì)的提取。