張 林， 楊劍飛， 于立偉， 于 晶， 王軍軍， 王振華， 劉顯君

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 黑龍江 哈爾濱150030）

我國鹽堿化土壤的分布十分廣闊，幾乎占我國國土的1／3，近1／5耕地發(fā)生鹽堿化，總面積達(dá)760萬hm2［1］。在鹽堿脅迫下，玉米的生長受到抑制，葉片失綠且生長緩慢，根系相對活力降低，相對生長量減少，并且隨著脅迫時間的延長而加劇［2－3］。選育和利用玉米耐鹽堿種質(zhì)資源選育耐鹽堿玉米品種是有效利用鹽堿地的重要手段，常用的鑒定方法包括發(fā)芽期篩選法［4］、苗期盆栽鑒定法［5］、大田鑒定法［6］等。其中苗期盆栽鑒定法被很多研究者采用，在溫室或人工氣候室中育苗，出苗后定期澆灌營養(yǎng)液保證植株生長所需養(yǎng)分，便于控制生長環(huán)境中的鹽堿含量及溫度、光照、通氣等生長條件，且在植物生長過程中易于調(diào)查形態(tài)指標(biāo)、生長指標(biāo)及相關(guān)生理生化等指標(biāo)。

目前多數(shù)研究者分別對玉米苗期耐鹽性鑒定和耐堿性鑒定體系進(jìn)行研究，并篩選出了適宜的篩選濃度，但實際上土壤鹽化和堿化的過程是相伴進(jìn)行的，因此鹽堿土壤是鹽化土和堿化土的綜合體，除含有大量的可溶鹽，還含有碳酸鈉等強(qiáng)堿性物質(zhì)［7］。為此，本研究以13份耐鹽堿性不同、來源不同的玉米自交系為試材，采用NaCl和Na2CO3混合溶液進(jìn)行脅迫處理，篩選出適宜濃度從而優(yōu)化苗期耐鹽堿性鑒定體系，并利用該體系對50份美國自交系進(jìn)行耐鹽堿性鑒定，旨在為耐鹽堿玉米種質(zhì)資源的規(guī)?；Y選和耐鹽堿遺傳育種提供技術(shù)和材料支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

根據(jù)文獻(xiàn)報道，選擇13份耐鹽堿性不同分別來自Lancaster、BSSS、SPT、PA、PB和地方種質(zhì)的玉米骨干自交系為供試材料［8］，用于耐鹽堿鑒定體系的優(yōu)化（見表1），以本課題組2012年從北美植物引種站引進(jìn)的美國玉米自交系50份（見表2），用于耐鹽堿材料的篩選和評價。種子均為2013年10月收獲，并采用標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗測定原始發(fā)芽率均為90%以上（見表1），由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所提供。

表1 13份供試玉米自交系

表2 50份美國玉米自交系

1.2 試驗方法

1.2.1 鹽堿脅迫濃度的篩選

目前對玉米苗期耐鹽堿混合溶液的篩選鑒定沒有公認(rèn)的脅迫濃度，本研究根據(jù)目前文獻(xiàn)報到的鹽脅迫濃度和堿脅迫濃度，設(shè)置4種不同濃度的鹽堿混合液，處理1為100mmol／L NaCl＋25mmol／L Na2CO3；處理2為100mmol／L NaCl＋30mmol／L Na2CO3；處理3為200mmol／L NaCl＋25mmol／L Na2CO3；處理4為200mmol／L NaCl＋30mmol／L Na2CO3。

選取飽滿一致供試玉米種子，10g／L的次氯酸鈉消毒20min，滅菌蒸餾水沖洗3遍，待種子萌發(fā)后將其移至裝有蛭石的塑料盆中培養(yǎng)幼苗，每盆定苗10株，幼苗長至3葉1心期，每天用含上述4種鹽堿混合液的1／2Hoagland溶液處理，對照以1／2Hoagland營養(yǎng)液澆灌，澆灌量為蛭石持水量的2倍，從而將蛭石中殘留鹽堿溶液洗掉，保持每個處理鹽堿溶液濃度的恒定，持續(xù)處理7d。處理和對照均按照隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，3次重復(fù)，每個重復(fù)50株幼苗。每個處理隨機(jī)選擇8株幼苗，觀察苗情，同時測定株高、干重、鮮重、含水量，并對株高、鮮重、干重及含水量變化率等指標(biāo)進(jìn)行差異顯著性分析，指標(biāo)測定方法和耐堿性分級方法使用崔美燕的報道［9］，篩選玉米苗期耐堿性鑒定的適宜脅迫濃度。

1.2.2 鹽堿脅迫濃度的驗證

精選飽滿一致供試玉米種子，采用盆栽種植的方式播種于體積約為30L（規(guī)格）的塑料桶內(nèi)，每桶播3～5粒種子，播種后澆水至有水滲出，出苗以后每桶保留1株。3次重復(fù)，每個重復(fù)30株幼苗。從3葉1心期開始用篩選出的適宜鹽堿混合溶液灌澆處理，對照采用清水灌澆，保持土壤含水量不低于田間持水量的55%，3d澆灌1次，每次2L，直至成熟。參照大田的施肥量，計算出每桶所需的施肥量，分別在播種前施底肥（磷酸二胺20kg／667m2、氯化鉀15kg／667m2、尿素15kg／667m2），拔節(jié)期和大喇叭口期前追施氮肥（尿素10kg／667m2）2次。收獲后每份材料隨機(jī)取5穗，待籽粒含水量降至14%測量平均穗重。根據(jù)各材料在鹽堿處理條件下的產(chǎn)量，參照柳斌輝等［10］的方法計算其耐鹽堿指數(shù)并進(jìn)行耐鹽堿性分級，本研究耐鹽堿性鑒定選擇對照材料為耐鹽堿材料 B 73［9，12］。將全生育期耐堿性鑒定結(jié)果與苗期鑒定結(jié)果進(jìn)行相關(guān)分析，驗證苗期耐堿性鑒定的適宜脅迫濃度。

1.2.3 50份玉米自交系耐鹽堿性鑒定

使用上述篩選出的玉米苗期耐堿性鑒定適宜鹽堿混合脅迫濃度，采用苗期盆栽方法對50份美國玉米自交系進(jìn)行耐鹽堿性鑒定，方法同1.2.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 適宜鹽堿脅迫濃度的篩選

由圖1～圖4可知，不同濃度NaCl和Na2CO3混合溶液處理下，13份自交系的株高、鮮重、干重和含水量均隨著混合溶液濃度的增高而降低，株高變化率、干重變化率、鮮重變化率和含水量變化率4個指標(biāo)在不同濃度下均表現(xiàn)出了顯著差異。在處理1的100mmol／L NaCl和25mmol／L Na2CO3混合濃度脅迫下出現(xiàn)了明顯降幅，NaCl濃度不變而Na2CO3濃度提高到30 mmol／L時下降趨勢平緩，而在處理3的200mmol／L NaCl和25mmol／L Na2CO3混合濃度脅迫下下降再次出現(xiàn)了明顯降幅，且材料間也出現(xiàn)了顯著差異。因此選擇200mmol／L的NaCl和25mmol／L的Na2CO3混合濃度為苗期鹽堿脅迫處理的適宜濃度。

圖1 不同鹽堿混合濃度脅迫對株高的影響

圖2 不同鹽堿混合濃度脅迫對鮮重的影響

2.2 13份玉米自交系苗期耐鹽堿性鑒定

根據(jù)苗情、株高、干重和鮮重變化率等表型指標(biāo)對13份供試材料進(jìn)行耐鹽堿性鑒定（結(jié)果見表3），各材料株高變化率、干重變化率和鮮重變化率差異顯著。其中P 138的株高變化率界于10%～25%之間，干重變化率界于20%～40%之間，鮮重變化率界于0～40%之間，苗情評價結(jié)果為2級，4個指標(biāo)聯(lián)合評價耐鹽堿級別為2級，屬于耐鹽堿材料。按照上述評級方法，P 138、吉853和黃早四耐鹽堿級別為2級，屬于耐鹽堿材料，B 73和龍抗11耐鹽堿級別為3級，屬于中度耐鹽堿材料；合344、K 10、東46和鄭58耐鹽堿級別為4級，屬于鹽堿敏感材料；東156、U 8112、齊319和Mo 17耐鹽堿級別為5級，為鹽堿高度敏感材料。

圖3 不同鹽堿混合濃度脅迫對干重的影響

圖4 不同鹽堿混合濃度脅迫對含水量的影響

進(jìn)而對苗情、株高、干重變化率和含水量變化率等4個評價指標(biāo)鑒定結(jié)果進(jìn)行了相關(guān)關(guān)系分析，結(jié)果見表4。4個指標(biāo)間存在著顯著或極顯著的正相關(guān)，其中苗情與株高變化率的相關(guān)系數(shù)最大，為0.97，株高變化率與干重變化率的相關(guān)系數(shù)最小，為0.64，說明4個評價指標(biāo)對供試材料耐鹽性分級的結(jié)果基本一致。

表4 4個表型指標(biāo)間的相關(guān)分析

表5 玉米全生育期依據(jù)產(chǎn)量表現(xiàn)耐鹽堿性鑒定結(jié)果

2.3 鹽堿脅迫濃度的全生育期驗證

采用篩選出的200mmol／L的NaCl和25mmol／L的Na2CO3混合鹽堿溶液定期澆灌盆栽玉米植株直至成熟期，以單株產(chǎn)量為指標(biāo)，通過耐鹽堿指數(shù)對13份耐鹽堿性級別不同的玉米自交系進(jìn)行耐鹽堿性評價，結(jié)果如表5所示，P 138耐鹽堿指數(shù)大于1.2，屬于高度耐鹽堿材料；黃早四和吉853耐鹽堿指數(shù)均界于1.0～1.19之間，屬于耐鹽堿材料；B 73和龍抗11耐鹽堿指數(shù)界于0.80～0.99之間，屬于中度耐鹽堿材料；K 10和東46耐鹽堿指數(shù)界于0.60～0.79之間，屬于鹽堿敏感材料；合344、東156、鄭58、U 8112、齊319和 Mo 17耐鹽堿指數(shù)均小于0.59，屬于鹽堿高度敏感材料。因為本研究選擇耐鹽堿材料B 73作為對照材料，因此黃早四的耐鹽堿指數(shù)為1。Mo 17和齊319鹽堿脅迫極其敏感而未能結(jié)實，因此無法測量單株產(chǎn)量。

將依據(jù)苗期表型指標(biāo)進(jìn)行耐堿性鑒定的結(jié)果與根據(jù)全生育期產(chǎn)量表現(xiàn)鑒定耐鹽堿性結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)為0.945，且達(dá)到極顯著水平，說明利用苗情、株高和干重變化率和鮮重變化率為評價指標(biāo)、200mmol／L 的NaCl 和25mmol／L的Na2CO3混合篩選濃度為選擇壓力的苗期盆栽鑒定法，是可操作性強(qiáng)、操作簡便、結(jié)果可靠的玉米耐鹽堿性鑒定方法。

表6 50份美國自交系耐鹽堿性鑒定結(jié)果

2.4 50份美國玉米自交系的耐鹽堿性的評價

采用篩選出的鹽堿混合脅迫濃度，采用苗期盆栽鑒定體系進(jìn)行了50份美國自交系的耐鹽堿性鑒定，分級結(jié)果如表6所示，50份材料中高度耐鹽堿材料3份，分別為PHBA 6、PHP 76和 PHR 62，占材料總數(shù)的6%，耐鹽堿材料11份，占材料總數(shù)的22%，中度耐鹽堿材料28份，占材料總數(shù)的56%，鹽堿敏感材料6份，占材料總數(shù)的12%，鹽堿高度敏感材料3份，分別為6M502A、BCC 03和PHR 47，占材料總數(shù)的4%。

3 討 論

本研究中選用的13份骨干玉米自交系中除吉853以外，其余均有耐鹽性或耐堿性鑒定的相關(guān)文獻(xiàn)報道［5，9，11－13］。 與 已 有 報 道 相 比，黃 早 四、鄭 58、U 8112、Mo 17和龍抗11的鑒定結(jié)果基本一致。部分材料的耐鹽性和耐堿性鑒定結(jié)果與文獻(xiàn)報道存在差異，如彭云玲等［13］認(rèn)為P 138是鹽敏感類型，崔美燕［9］認(rèn)為是耐堿類型，本鑒定結(jié)果為高耐鹽堿；合344在付艷等［12］報道中認(rèn)為是耐鹽類型，崔美燕認(rèn)為是堿敏感類型，本鑒定結(jié)果為高感鹽堿；東156、東46、齊319和K 10在付艷等［12］、崔美燕［9］、單長建［5］報道中被分別認(rèn)為是耐鹽類型和中耐堿類型，本鑒定結(jié)果為高感鹽堿。原因可能是由于本研究對材料同時進(jìn)行中高強(qiáng)度的鹽脅迫和堿脅迫，鹽脅迫下玉米受到高濃度的Na＋作用，膜系統(tǒng)受到了傷害，光合作用下降導(dǎo)致材料生長受阻，而在Na2CO3的聯(lián)合脅迫作用下，離子平衡遭到更大的破壞，Na＋區(qū)域化能力受到限制，活性氧清除能力顯著減小，膜系統(tǒng)受到嚴(yán)重?fù)p害，其傷害作用遠(yuǎn)大于NaCl單獨(dú)存在時對細(xì)胞膜造成的損害，因此會導(dǎo)致材料在單獨(dú)鹽脅迫、單獨(dú)堿脅迫和鹽堿混合脅迫時耐鹽堿級別不統(tǒng)一。本研究中采用全生育期鹽堿混合脅迫處理、以產(chǎn)量表現(xiàn)為依據(jù)的鑒定結(jié)果來驗證苗期鑒定結(jié)果的可靠性，二者達(dá)到極顯著正相關(guān)水平，證明本研究結(jié)果真實可靠。考慮到鹽堿土壤中中性鹽與堿性鹽通常并存，鹽堿混合脅迫鑒定方法在實際應(yīng)用中價值更大。

耐鹽堿材料的篩選和鑒定耐鹽堿玉米新品種的培育具有重要的意義，本研究采用優(yōu)化的耐鹽堿鑒定方法對50份美國自交系進(jìn)行了評價，篩選出高耐鹽堿材料3份和耐鹽堿材料11份，這些資源對于后續(xù)的雜交組合配制選育耐鹽堿玉米新品種，以及優(yōu)良遺傳分析群體等具有重要意義。

［1］周和平，張立新，禹峰，等.我國鹽堿地改良技術(shù)綜述及展望［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2005，12（6）：28－31.

［2］Katerji N，Van Hoorn J W，Hamdy A，et al.Salinity effect on crop development and yield，analysis of salt tolerance according to several classification methods［J］.Agricultural water management，2003，62（1）：37－66.

［3］斯琴巴特爾，吳紅英.鹽脅迫對玉米種子萌發(fā)及幼苗生長的影響［J］.干旱區(qū)資源與環(huán)境，2000，14（4）：76－80.

［4］時麗冉.混合鹽堿脅迫對玉米種子萌發(fā)的影響［J］.衡水學(xué)院學(xué)報，2007，9（1）：13－15.

［5］單長建.抗逆轉(zhuǎn)基因玉米苗期耐鹽堿評價方法的初步建立及功能驗證［D］.哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

［6］張春宵，袁英，劉文國，等.玉米雜交種苗期耐鹽堿篩選與大田鑒定的比較分析［J］.玉米科學(xué)，2010，18（5）：14－18.

［7］尹喜霖，王勇，柏鈺春.淺論黑龍江省的土地鹽堿化［J］.水利科技與經(jīng)濟(jì)，2004，10（6）：361－363.

［8］Xie C X，Zhang S H，Li M S，et al.Inferring Genome Ancestry and Estimating Molecular Relatedness Among 187 Chinese Maize Inbred Lines［J］.Journal of Genetics and Genomics，2007，34（8）：738－748.

［9］崔美燕.玉米苗期耐堿種質(zhì)資源評價及鹽堿條件下部分性狀遺傳分析［D］.大慶：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，2009.

［10］柳斌輝，張文英，栗雨勤.玉米耐鹽性的鑒定評價［J］.華北農(nóng)學(xué)報，2012，27：101－105.

［11］楊書華，張春宵，樸明鑫，等.大田苗期耐鹽堿鑒定指標(biāo)篩選及玉米自交系鹽堿耐性分析［J］.種子，2012，31（1）：9－13.

［12］付艷，高樹仁，王振華.玉米種質(zhì)苗期耐鹽性的評價［J］.玉米科學(xué)，2009，17（1）：36－39.

［13］彭云玲，李偉麗，王坤澤，等.NaCl脅迫對玉脅迫對玉米耐鹽系與鹽敏感系萌發(fā)和幼苗生長的影響［J］.草業(yè)學(xué)報，2012，21（4）：62－71.