廖 倩， 胡尚連， 曹 穎， 黃 艷， 馮璐璐

（1.西南科技大學生命科學與工程學院， 四川 綿陽621010；2.四川省生物質資源利用與改性工程技術研究中心， 四川 綿陽621010）

花魔芋（Amorphophallus albus）是栽培面積較廣的魔芋品種之一，具有很高的藥用和食用價值，其魔芋精粉及衍生物在農業(yè)、紡織、建筑、化工等行業(yè)得到廣泛應用［1－3］。北川花魔芋是四川北川羌族自治縣的著名特產，具有與其他地域魔芋產品的不同優(yōu)異產品特性，獲得了農業(yè)部頒發(fā)的農產品地理標志證書，進入我國農產品地理標志保護行列。北川花魔芋生產上主要依靠半野生種逐步馴化，由于長期連續(xù)采挖，野生魔芋資源瀕臨枯竭［4］。此外，由于缺乏穩(wěn)定的良種繁育體系，種芋帶病且病害逐年加重，種芋的數量和質量已經成為北川花魔芋生產發(fā)展的瓶頸［5］。因此，針對北川花魔芋種質資源保存、品種純化復壯，建立愈傷組織與試管微球莖離體誘導及脫毒繁育體系，對北川花魔芋進一步研究和利用具有重要意義［6－8］。本研究利用組織培養(yǎng)方法，嘗試以北川花魔芋的根狀莖、嫩葉和葉柄為外植體，建立適合北川花魔芋的愈傷組織誘導和微型試管芋（擬球莖）培養(yǎng)技術，以實現在試管內全年生產種芋，為北川花魔芋良種繁育技術奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

北川花魔芋采自于四川省綿陽市北川羌族自治縣安昌鎮(zhèn)幸福村，以2月齡植株的葉柄、嫩葉、葉脈以及根狀莖為外植體。

1.2 方 法

1.2.1 外植體處理及接種

將外植體用自來水沖洗2h后，置于超凈臺上，用75%乙醇消毒30s，用無菌水清洗3～4次，再用0.1%的升汞溶液處理10min，最后用無菌水沖洗3～5次。將消毒后的葉柄切割成薄片（厚度為2～3mm），葉片切割成1cm2左右的方塊，根狀莖切成約2cm的小段，葉脈切成厚度為2mm左右的長條，將各外植體接種于相應的培養(yǎng)基上。每個處理接種30瓶，葉柄2塊／瓶，根狀莖4塊／瓶，葉脈10塊／瓶，葉片20片／瓶；試驗重復3次。

1.2.2 不同外植體對愈傷組織誘導的影響

將不同外植體接種于 MS＋1.0mg／L 6－BA＋0.1 mg／L NAA＋3%蔗糖＋0.8%瓊脂培養(yǎng)基中，置于25±1℃黑暗培養(yǎng)，觀察愈傷組織誘導情況，30d后統(tǒng)計誘導率。愈傷組織誘導率（%）＝形成愈傷組織的外植體數／接種外植體總數×100%。

1.2.3 不同激素濃度配比對愈傷組織誘導的影響

以MS＋3%蔗糖＋0.8%瓊脂為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的6－BA（1.0mg／L 和1.5mg／L）和 NAA（0.1mg／L和0.5mg／L），pH 值為5.8；將接種后的外植體置于（25±1）℃黑暗培養(yǎng)，觀察愈傷組織誘導情況，30d后統(tǒng)計誘導率。

1.2.4 繼代與分化

外植體培養(yǎng)6周后，選取生長良好的魔芋愈傷組織置于25±1℃、弱光條件下（弱散射光強度約500 lx）進行繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)基為 MS＋0.5mg／L 6－BA＋0.5mg／L NAA，每30d繼代1次。觀察并記錄愈傷組織變化情況，統(tǒng)計愈傷組織類型比例、增殖系數以及出芽率。增殖頻率＝繼代過程中發(fā)生增殖的愈傷組織所占的比例。

1.2.5 魔芋試管微型芋的誘導

繼代培養(yǎng)2～3次后，將愈傷組織切成適當大小的小塊，轉入 MS＋2.0mg／L 6－BA＋0.5mg／L NAA＋5%蔗糖培養(yǎng)基中［9］進行試管微球莖誘導試驗。

2 結果與分析

2.1 不同外植體類型對愈傷組織誘導的影響

試驗中大多數外植體均不同程度誘導出了愈傷組織，但不同外植體愈傷組織形成的時間、形成位置以及愈傷組織質地和顏色等均有較大差異。如圖1所示，在 MS＋1.0mg／L 6－BA＋0.1mg／L NAA的誘導培養(yǎng)基中，葉柄培養(yǎng)10d后出現卷曲且邊緣開始變紅（圖1a），3周后形成愈傷組織。首先是在切面上會形成許多白色的瘤狀小突起，隨后瘤狀小突起不斷變大最后覆蓋了整個外植體（圖1b），部分葉柄邊緣開始變?yōu)楹谏▓D1c）。接種后的葉片增厚膨大，約3周后顏色變淡，邊緣切口處變?yōu)楹稚▓D1d）。葉脈接種1周后，體積膨大（圖1e），培養(yǎng)2周左右，葉脈切口出現瘤狀小突起（圖1f），但隨后僅極少形成瘤狀結構愈傷組織。根狀莖在接種后4d左右出現部分變色（圖1g），3周之后體積發(fā)生膨大，并且部分生長出根狀物（圖1h），進一步培養(yǎng)后部分根狀莖出現粉色或白色的瘤狀的愈傷組織，并伴有長滿白色毛的根狀物（圖1i）。從表1中可以看出，不同的外植體形成愈傷組織的能力有明顯的不同，從表中可知葉柄外植體（35.0%）和根狀莖外植體（32.1%）愈傷組織誘導率明顯高于其它類型的外植體。

表1 不同類型外植體的愈傷組織誘導率

2.2 不同激素濃度配比對愈傷組織誘導的影響

由表2可見，不同激素組合對魔芋愈傷組織的誘導效果不一，在相同激素配比下，不同外植體誘導效果出現較大差異。就葉柄而言，各培養(yǎng)基中的愈傷組織誘導率均高于另外2種外植體，其中MS＋1.0mg／L 6－BA＋0.5mg／L NAA 誘導效果最好，誘導率為48.3%，誘導率快，愈傷數多；而在該培養(yǎng)基中，葉脈和葉片愈傷誘導率明顯偏低，均低于20%；葉片在MS＋1.5mg／L 6－BA＋0.5mg／L NAA 培養(yǎng)基上的愈傷誘導效果較好，然而誘導率僅有16.2%；葉脈在MS＋1.0 mg／L 6－BA＋0.1mg／L NAA培養(yǎng)基上的愈傷誘導效果較好，誘導率為21.7%。

圖1 不同外植體在愈傷組織誘導培養(yǎng)基上的培養(yǎng)反應

表2 不同的NAA和BA濃度對魔芋不同外植體愈傷組織誘導的影響

2.3 繼代培養(yǎng)過程中愈傷組織類型、增殖頻率及其分化能力分析

各種外植體初誘導出的愈傷組織，均結構疏松，而繼代2～3次后，愈傷組織會形成3種明顯不同的類型（圖2，表3）。Ⅰ型為半透明的愈傷組織，沒有生長和分化能力，在光照條件下會迅速褐化、壞死（圖2a）。Ⅱ型為淺灰褐色、愈傷組織結構疏松狀，增殖頻率約為63.6%，但不易分化出芽（圖2b）。Ⅲ型愈傷組織較白，稍帶綠色或者粉色，結構致密、質地堅硬，其表面成球狀或瘤狀（圖2c），該類型的愈傷組織生理狀態(tài)好，增殖頻率較高（90.8%），容易分化出不定芽和微球莖；部分芽直接在愈傷組織上發(fā)生，有的則通過擬球莖（其形態(tài)與魔芋田間球莖相似）發(fā)生，后者長成的植株較健壯。

表3 繼代培養(yǎng)3次后魔芋愈傷組織類型

2.4 魔芋微球莖的形成

微球莖誘導情況見圖3，將獲得的Ⅲ型愈傷組織轉入含有5%蔗糖的微球莖誘導培養(yǎng)基后，經過4周培養(yǎng)，愈傷組織開始形成微球莖，繼續(xù)培養(yǎng)至第8周可見大量生長良好的微球莖，該微球莖表皮淺褐色，帶大量芽點，1～2cm大小。可見，5%蔗糖有利于促進微球莖的形成。

3 討 論

魔芋在離體培養(yǎng)過程中一般需要經歷2個過程，即愈傷組織誘導階段和分化培養(yǎng)階段。研究表明，分裂素6－BA與生長素NAA配合使用對魔芋愈傷組織誘導與分化具有明顯促進作用［10－11］。本試驗結果也進一步證實了該結論，不同濃度配比的6－BA與NAA可不同程度地誘導愈傷組織的發(fā)生。在誘導過程中，外植體的類型與愈傷組織的誘導率、顏色、質地具有密切聯(lián)系。莊承紀［10］與謝慶華［12－13］等認為，根狀莖是魔芋誘導愈傷組織的最佳外植體，而本研究結果發(fā)現，以葉柄為外植體其愈傷組織誘導效果均高于其他器官，包括根狀莖。

圖2 花魔芋愈傷組織的3種類型

圖3 魔芋微球莖

魔芋組織培養(yǎng)過程中器官發(fā)生途徑主要包括：外植體—愈傷組織—不定芽—生根成苗；外植體—愈傷組織—生根長芽成苗；外植體—愈傷組織—胚狀體成苗以及外植體—愈傷組織—小塊莖—成苗等［11，14］。由此可見，愈傷組織的狀態(tài)對器官分化具有重要影響。Hu等認為，魔芋愈傷組織可形成3種不同類型，這3種類型愈傷組織在不同的培養(yǎng)條件下還可以相互轉變［15］。本試驗結果同樣獲得3種愈傷類型，即半透明Ⅰ型，淺灰褐色、愈傷組織結構疏松狀的Ⅱ型，以及稍帶綠色或者粉色，結構致密、質地堅硬的Ⅲ型愈傷組織。Ⅲ型的愈傷組織生理狀態(tài)好，增殖頻率較高，容易分化出不定芽和微球莖。但在培養(yǎng)過程中未發(fā)現相互轉化現象，Ⅰ型愈傷在繼代過程中出現褐化現象并死亡。同時試驗表明，北川花魔芋器官發(fā)生途徑主要為外植體—愈傷組織—不定芽—生根成苗和植體—愈傷組織—小塊莖—成苗2種途徑，后者中的小塊莖即擬球莖，它具有與田間魔芋相同的繁殖方式，獨立培養(yǎng)可以產生很多新的小球莖，實現了“器官－器官”的繁殖方式。擬球莖是一種微型變態(tài)繁殖器官，具有體積小、可貯運、易長苗、易生根等優(yōu)點，在魔芋種芋繁殖中有望代替試管苗。

北川花魔芋的組織培養(yǎng)過程中，雖然成功誘導了具有分化能力的愈傷組織以及微球莖，但仍存在很多的問題，如魔芋微球莖誘導率的提高、繁殖過程中病毒、病源菌的脫病率等，尚待進一步的研究。

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