楊榮超， 章月琴， 豐 鋒， 丁小明， 齊 飛

（1.廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 廣東 湛江524088；2.農(nóng)業(yè)部規(guī)劃設(shè)計(jì)研究院設(shè)施農(nóng)業(yè)研究所， 北京100026

Real time RT－qPCR （real－time quantitative reverse transcription－PCR）是檢測樣本中基因表達(dá)量的有效方法，具有靈敏、準(zhǔn)確、快速、所需樣品量小、操作技術(shù)簡單等諸多優(yōu)點(diǎn)，是目前檢測基因表達(dá)的有效方法［1－2］。然而，該方法卻受到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、引物、模板的質(zhì)量、內(nèi)參的選擇及數(shù)據(jù)分析的方法等多個(gè)因素的影響。因此，保證RNA的完整性及純度在分析基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)豐度的研究中起到重要的作用，然而，有些研究必須利用特定的植物組織，比如植物的種子。但是，植物的種子內(nèi)含有大量的多糖、貯藏蛋白、脂肪，多數(shù)還含有酚、酮等多種次生代謝物質(zhì)，這些物質(zhì)給獲得完整和高純度的RNA帶來了很大麻煩［3］。

目前，在實(shí)際的研究過程中有多種提取種子RNA的方法和試劑盒，但是提取RNA的基本原理是相通的，不同方法之間區(qū)別通常只是改變了其中某種試劑，從而有利于某些特殊的成分降解［4－6］。除去通過改變提取試劑來提取不同組織的高質(zhì)量的RNA外，提取過程中的主要操作同時(shí)也起到非常重要的作用。本研究優(yōu)化了華越洋生物科技有限公司RNA提取試劑盒的主要操作流程，能夠從番茄種子中獲得大量完整的RNA。另外，排除DNA的干擾和污染也是得到可靠結(jié)論的前提和必要條件［7－9］。為了有效排除DNA的污染和干擾，通常利用DNA酶消除DNA，另外，還可以通過設(shè)計(jì)跨越表達(dá)基因內(nèi)含子的引物，然后再利用PCR擴(kuò)增的方法來檢測模板的純度。雖然這兩種方法應(yīng)用比較廣泛，但仍然具有一定的局限性。針對不同方法的優(yōu)劣，本研究通過設(shè)計(jì)跨越內(nèi)參基因內(nèi)含子的引物，利用這對引物擴(kuò)增分析待測樣品是否被基因組DNA污染。這種方法為快速從種子中獲得高質(zhì)量的 Real time RT－q PCR模板提供了有效的保證。

1 材料方法

1.1 植物材料

番茄（Solanum lycopersicum）LA 2711（L.esculentumcv.Edkawi LA 2711），由番茄遺傳資源中心（Tomato Genetic Research Center，TGRC）提供，中蔬5號（ZS－5），來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所。這2種番茄都是栽培品種，果實(shí)較大。

1.2 RNA的提取

挑選取2種番茄大小基本一致的種子200粒供試驗(yàn)用，種子直接置于9cm直徑培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)皿內(nèi)鋪4層濾紙，每天添加3～4mL的滅菌水，保證培養(yǎng)皿內(nèi)的足夠濕度。2種番茄分別播種4皿，每培養(yǎng)皿播種40粒。培養(yǎng)條件為：日溫（24±1）℃，夜溫（22±1）℃，16h光照／8h黑暗光周期。分別選取吸脹0，12，18，24，36，48h的種子，利用液氮快速保存后儲存于－80℃冰箱備用。

種子內(nèi)富含蛋白質(zhì)、脂肪及多糖，要獲取高質(zhì)量的RNA比較困難。本研究對華越洋公司RNA提取試劑盒的提取流程進(jìn)行相應(yīng)的改進(jìn)，獲得大量并且完整的種子RNA。RNA的提取流程如下：

膜上DNA的消化流程：

1）9μL RNase－free DNase 1＋66μL DNase Buffer，在干凈的離心管中充分混勻，加入到離心吸附柱的中央，放置20min，且必須放置一段時(shí)間，才能夠充分去除DNA。12 000g離心1min，棄穿透液。

2）加0.5mL去酶液，輕柔顛倒50次，保證RNA的完整性。12 000g離心1min，棄穿透液。重復(fù)上步實(shí)驗(yàn)。

3）12 000g離心2min，主要目的是去除殘留去酶液，其主要物質(zhì)是乙醇，否則乙醇會影響RNA的后續(xù)應(yīng)用。

4）50～100μL RNA洗脫液，室溫放置5min，12 000g離心1min。

5）再將洗脫液重新加入離心管，室溫放置5min，12 000g離心1min，立即使用或－80℃條件存放。

1.3 方法原理

本研究的核心是設(shè)計(jì)一對跨越內(nèi)參基因（EF 1α）內(nèi)含子（78bp）的引物，利用這對引物以不同的模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如果反轉(zhuǎn)錄后的cDNA模板被DNA污染，利用這對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，則能夠擴(kuò)增出441bp的片段；如果cDNA模板沒有被DNA污染，則擴(kuò)增出來為363bp的片段。通過這種策略能夠快速檢測出DNA的污染。

1.4 PCR及qRT－PCR擴(kuò)增

反轉(zhuǎn)錄利用的是TakaRa試劑盒（DRR 037S）。利用跨越內(nèi)參基因（EF 1α）內(nèi)含子的引物PCR擴(kuò)增。PCR的擴(kuò)增體系20μL，模板分別為：H2O，DNA，RNA轉(zhuǎn)錄后的cDNA，沒轉(zhuǎn)錄的RNA。反應(yīng)條件：95℃5min，95℃30s，60℃30s，72℃，45s，共30個(gè)循環(huán)。

表1 各實(shí)驗(yàn)所用的引物列表

熒光定量PCR利用96孔羅氏LightCycler 480儀器（Roche Diagnostics，Basel，Switzerland）。20μL的反應(yīng)體系包括10μL SYBR Primerx Ex Taq（Takara，kyoto，Japan），1.0μL cDNA 模板，上下游引物10 μmol／L各加0.8μL，加ddH2O 6.4μL補(bǔ)足20μL。反應(yīng)條件：95℃30s；95℃5s，60℃25s，共40個(gè)循環(huán)。每一個(gè)樣品3個(gè)技術(shù)重復(fù)，利用番茄PP 2Acs基因的正向引物和反向引物作為內(nèi)對照，所有候選基因以及PP 2Acs基因引物序列見表1［10］，引物由上海生工生物工程有限公司合成。熒光定量數(shù)據(jù)的計(jì)算方法以2－ΔΔCT方式計(jì)算［11］。

1.5 數(shù)據(jù)分析

方差分析采用SAS 8.0軟件的ANOVA過程處理，顯著性檢驗(yàn)采用鄧肯法。有關(guān)作圖采用Excel 2007、SigmaPlot和 Adobe Illustrator CS 5軟件。

2 結(jié)果分析

2.1 RNA的完整性分析

獲得高質(zhì)量、能正確反映樣品中轉(zhuǎn)錄豐度的RNA，對于其后續(xù)定量結(jié)果的準(zhǔn)確性起到至關(guān)重要的作用。通過改進(jìn)“華越洋公司”RNA提取試劑盒，變性瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，18S和28S的條帶明顯而且都比較完整，從圖片的亮度可以看出，rRNA比率［28S／18S］≥1（圖1）。

圖1 RNA的變性瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析

2.2 利用跨越內(nèi)含子的內(nèi)參基因擴(kuò)增結(jié)果分析

圖2 合成cDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

利用跨越內(nèi)含子的EF 1α作為引物，分別以滅菌H2O為隱性對照、種子的DNA為陽性對照、RNA和cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過圖2（A，B）可看出，以種子基因組DNA為模板擴(kuò)增出一條441bp的條帶；以H2O和RNA為模板沒有擴(kuò)增出條帶；以cDNA為模板則擴(kuò)增出363bp的條帶。

2.3 種子萌發(fā)過程中2個(gè)基因的qRT－PCR表達(dá)分析

圖3 ABA合成基因表達(dá)分析

為了驗(yàn)證上述策略的可靠性，對反轉(zhuǎn)錄后的樣板進(jìn)行熒光定量PCR分析，通過圖3（A，B）在80～90℃溫度范圍內(nèi)，2個(gè)基因的溶解曲線只有1個(gè)單峰，并且出峰的位置在設(shè)置的退火溫度，說明沒有非特異性擴(kuò)增出來，即 Real time RT－q PCR 的模板沒有受到DNA的污染和干擾。在番茄種子萌發(fā)的過程中，SlNCED1的相對表達(dá)值很低甚至不表達(dá)，而SlNCED2的表達(dá)較高（圖3C）。SlNCED2在2種番茄中的表達(dá)規(guī)律都是先降低后升高然后再降低的趨勢。在0h處SlNCED2的表達(dá)量是種子中萌發(fā)過程的最大值，該基因在LA 2711的相對表達(dá)量是ZS－5的2倍；在12h該基因的表達(dá)又降低到最低值，該基因在LA 2711中的相對表達(dá)量是ZS－5的0.87倍，為0～12 h，該基因LA 2711中的下降程度顯著高于ZS－5。在18h處，LA 2711的表達(dá)值又上升，然后又顯著降低，但是該基因在18～24h時(shí)間內(nèi)，在ZS－5中的表達(dá)一直保持較高的值，而后才降低。

3 討 論

Real time RT－qPCR 技術(shù)是一種快速、簡便、準(zhǔn)確、靈敏、成本低廉的基因表達(dá)分析方法。然而，由于技術(shù)的簡單性及敏感性使得它在實(shí)驗(yàn)過程由于模板的純度不夠而導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)明顯的偏離甚至背離。因此，如何控制實(shí)驗(yàn)過程中模板的純度也是研究過程中必須解決的問題。目前，雖然在提取RNA的過程中，為了避免DNA的污染，常常利用DNA的溶解酶溶解RNA樣品中的 DNA，但是由于 Real time RT－qPCR非常敏感，即使存在微量的DNA也會對結(jié)果造成顯著的影響。當(dāng)然，在DNA污染比較嚴(yán)重的情況下，其溶解曲線也會出現(xiàn)明顯的偏離，通過這種途徑也可以發(fā)現(xiàn)模板被DNA污染，但是這樣通常會造成時(shí)間及試劑的浪費(fèi)。在實(shí)驗(yàn)過程中，常用的一種方法是每個(gè)表達(dá)基因的引物跨越內(nèi)含子，這樣利用PCR的方法也能夠證明模板的污染情況，但是如果同時(shí)分析大量基因時(shí)要保證每個(gè)基因都跨越內(nèi)含子的引物，這樣保證每對引物的質(zhì)量困難很大［12－13］。本研究是利用跨越內(nèi)含子的內(nèi)參基因引物快速檢測已經(jīng)反轉(zhuǎn)錄完成的cDNA是否被DNA污染，這種方法首先可以避免多個(gè)表達(dá)基因的引物都要跨越內(nèi)含子給設(shè)計(jì)引物帶來的麻煩。另外，這種方法也是熒光定量分析前快速、有效的方法，這樣通常能夠避免由于DNA的污染帶來的不必要的試劑浪費(fèi)。當(dāng)然，目前也有一些學(xué)者不推薦利用跨越內(nèi)含子的引物來檢測模板的純度，主要原因是超過20%人類基因被認(rèn)為是單一外顯子基因［2］，因此，利用跨越內(nèi)含子引物檢測也具有一定的局限性。但是模式植物上一些內(nèi)參基因的結(jié)構(gòu)信息已經(jīng)非常明確，通過設(shè)計(jì)看家基因跨越內(nèi)含子的引物來檢測DNA的污染還是非常有效的方法。

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