李吟平， 程秋香， 席鵬洲， 王宏迪， 張躍進， 張小燕

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 陜西 楊凌712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 陜西 楊凌712100）

黃精（學(xué)名：Polygonatum sibiricumRed），又名： 雞頭黃精、爪子參、老虎姜、雞爪參。系百合科黃精屬植物，集藥用、美容、食用以及觀賞價值于一身［1］。黃精種類繁多，作為藥材使用的為黃精（Polygonatum sibiricumRed）、多花黃精（Polygonatum cyrtonema Hua）和滇黃精（Polygonatum kingianumColl），始載于《名醫(yī)別錄》［2］。

黃精在現(xiàn)行的人工栽培中多采用塊莖進行無性繁殖，不僅會導(dǎo)致藥材本身的浪費，也會對藥材的品質(zhì)造成巨大影響，更會使其后代退化越來越嚴重。所以，利用黃精實生種子進行繁殖是解決以上問題的有效途徑［3］。目前，對黃精種子萌發(fā)特性、破眠方法以及繁育方式等方面研究的報道較多，但對其種子貯藏生理的研究未見報道。種子含水量和貯藏溫度是決定種子在貯藏期間活力保持的關(guān)鍵因素［4］。Harrington早在1973年就概括出了種子壽命與種子含水量及貯藏溫度間的規(guī)則，即Harrington通則：種子在5%～14%的含水量范圍內(nèi)，每降低1個百分點，種子壽命就會延長一倍，貯藏溫度在0～50℃之間每降低5℃，種子壽命也會延長一倍［5］。當(dāng)含水量相同時，貯藏溫度越高，種子活力降低越快，種子壽命也越短［6］。本實驗旨在研究黃精種子在不同含水量條件下，隨著貯藏時間的延長其生理生化的變化及含水量對種子活力的影響，以尋求黃精種子常溫貯藏條件下最佳種子含水量，為黃精種質(zhì)資源保存與利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

本實驗所用黃精種子于2014年11月采自陜西省漢中市略陽縣烏龍洞鎮(zhèn)步長集團黃精規(guī)范化種植基地。采收后經(jīng)堆積發(fā)酵、揉搓漂洗去皮后所得種子。待種子自然風(fēng)干后挑選籽粒飽滿、無破損、無病蟲害的種子用于實驗。

1.2 方 法

1.2.1 種子含水量的調(diào)整

黃精種子自然晾干后的含水量根據(jù)國際種子檢驗規(guī)程，采用低溫烘干法進行測定。所測得的自然含水量為10%。本實驗所用種子含水量分別為：15%、10%、7%和3%。將不同含水量的黃精種子貯藏在同一溫度條件下，即室溫條件下。

3%和7%含水量種子的獲得：準(zhǔn)確稱取2份100 g黃精種子，用2層紗布包裹，放入盛有變色硅膠的干燥器中，每日更換硅膠。待種子重量減少為96.3g時，種子含水量為7%，拿出一份種子放入聚乙烯袋中進行密封保存；另一份種子繼續(xù)干燥，待種子重量減輕到92.7g時即為3%含水量的種子，密封保存方法同上。

15%含水量種子的獲得：稱取100g的黃精種子，將其放置在70%～80%的濕度、25℃的環(huán)境下每天測其重量，待種子重量達到103.5g時即為15%含水量的種子。

從2015年3月4日開始，各處理的種子均貯藏5個月，每月3號取樣測定各項指標(biāo)。

1.2.2 指標(biāo)測定

1）過氧化氫酶CAT、超氧化物歧化酶SOD、過氧化物酶POD活性的的測定方法參照路文靜主編《植物生理學(xué)實驗教程》進行測定［7］。

2）相對電導(dǎo)率的測定：取黃精種子50粒，3次重復(fù)，稱重，用去離子水沖洗5次，置于250mL的錐形瓶中，設(shè)置空白對照，在每個樣品瓶中（包括對照）加入去離子水200mL，用保鮮膜封口，放入20℃恒溫箱中24h，挑出未吸脹種子，晾干后稱重，用同一樣品最初的重量減去未吸脹種子重量，用電導(dǎo)儀測定種子浸出液電導(dǎo)率，減去空白對照的電導(dǎo)率即為樣品的電導(dǎo)率。

電導(dǎo)率［μS／（cm·g）］＝（樣品電導(dǎo)率－對照值）／樣品重量。

3）MDA（丙二醛）含量的測定：參考高俊鳳主編《植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)》丙二醛含量測定的方法進行測定［8］。

4）可溶性糖含量的測定：參考路文靜主編《植物生理學(xué)實驗教程》，蒽酮比色法測定可溶性糖含量［7］。

5）可溶性蛋白含量的測定：參考高俊鳳主編《植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)》，考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白含量［8］。

6）粗脂肪含量的測定：參考高俊鳳主編《植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)》，植物組織中粗脂肪含量的測定［8］。

7）發(fā)芽率的測定：取籽粒飽滿無損傷的黃精種子120粒，用3%的H2O2浸泡種子15min，蒸餾水沖洗3次，再用40℃溫水浸泡30h，40粒種子一皿，3次重復(fù)。所用培養(yǎng)皿鋪2層濾紙，適量澆水，黑暗培養(yǎng)60 d，培養(yǎng)箱溫度控制在（25±1）℃，隔天觀察，并記錄發(fā)芽數(shù)［3］。其中3%含水量的種子在此實驗前需進行種子緩濕處理，緩濕方法：黃精種子在80%RH（相對濕度）條件下緩濕5d（配制濃度為27.3%的硫酸，放入干燥器底部，種子放置在干燥器中的白瓷板上，密封干燥器，創(chuàng)造80%的 RH）［9］。

種子發(fā)芽率的計算公式：發(fā)芽率（%）＝發(fā)芽的種子數(shù)／供檢測的種子數(shù)×100%。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用DPS 2006和EXCEL 2007對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計和分析，采用方差分析中Duncan’s對實驗數(shù)據(jù)的差異顯著性進行估算。

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 含水量對黃精種子過氧化氫酶（CAT）活性的影響

CAT是植物組織中普遍存在的重要保護酶之一，其主要作用是清除細胞代謝過程中產(chǎn)生的H2O2，避免過多的H2O2的積累對細胞造成氧化損傷［4］。其活性是判定種子活力的一項重要指標(biāo)。如圖1所示，不同含水量的黃精種子在貯藏5個月期間，CAT活性先下降再上升再下降，此現(xiàn)象可能與種子的生理后熟有關(guān)，陸秀君等研究表明，種子在后熟期間過氧化物酶、過氧化氫酶活性會升高［10］。在貯藏3個月之后，黃精種子CAT活性開始大幅降低，其中15%含水量的種子CAT活性降低最快，3%降低最慢。從下降趨勢來看，10%和15%含水量的種子降低趨勢較大，3%和7%含水量的種子降低幅度較小。從圖1可以看出，黃精種子在貯藏期間，含水量越高的種子CAT活性越低并且降低越快。

圖1 含水量對黃精種子過氧化氫酶（CAT）活性的影響

2.2 含水量對黃精種子超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

SOD是生物體內(nèi)普遍存在的一種參與氧代謝的含金屬酶，與植物衰老及抗逆性緊密相關(guān)，是植物重要的保護酶之一。在種子貯藏期間，該酶活性的指標(biāo)是確定種子活力的一個重要標(biāo)志。由圖2可以看出，不同含水量的黃精種子在貯藏期間SOD活性均有不同程度的下降，3%含水量的種子SOD活性始終較其他含水量種子高而且活力下降幅度很小，15%含水量的種子SOD活力下降速度最快。10%和15%含水量的種子從貯藏第4個月開始，SOD活性有持續(xù)快速下降的趨勢。這表明低含水量貯藏的黃精種子可通過增強清除自由基的能力，減少膜損傷程度。

2.3 含水量對黃精種子過氧化物酶（POD）活性的影響

POD是植物體內(nèi)普遍存在的一種酶，其活性較高，參與植物細胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)，能有效清除細胞內(nèi)的H2O2，是植物體內(nèi)的一種保護酶。由圖3可看出，不同含水量的黃精種子在貯藏過程中POD活性存在一定差異。在貯藏3個月的時候，3%和7%含水量的種子POD活性達到最大值。隨著貯藏時間的延長，種子POD活性均下降，含水量越高，種子POD活性下降越快。3%含水量的黃精種子貯藏5個月后POD活性下降較貯藏前只有很小的變化。

圖2 含水量對黃精種子超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

圖3 含水量對黃精種子過氧化物酶（POD）活性的影響

2.4 含水量對黃精種子浸出液相對電導(dǎo)率的影響

種子活力與電導(dǎo)率之間的關(guān)系最早由Hihbard發(fā)現(xiàn)并提出，他對小麥和玉米等農(nóng)作物的電導(dǎo)率做了最早的研究。它也是表示種子活力高低的一項重要指標(biāo)［11］。不同含水量的黃精種子在貯藏期間種子浸出液相對電導(dǎo)率變化總體上均表現(xiàn)出逐漸升高的趨勢。如圖4所示，10%和15%含水量的種子相對電導(dǎo)率持續(xù)上升，15%上升幅度最大；3%和7%的種子相對電導(dǎo)率升幅較慢，且分別在貯藏3個月和4個月以后逐漸下降，這表明低含水量的種子細胞膜結(jié)構(gòu)相對較穩(wěn)定，膜系統(tǒng)的受損程度較輕。

圖4 含水量對黃精種子浸出液相對電導(dǎo)率的影響

2.5 含水量對黃精種子丙二醛（MDA）含量的影響

MDA是植物組織活性氧積累誘發(fā)的膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，因此可以通過測定MDA的含量來了解膜脂過氧化程度的高低。MDA含量是種子劣變程度的一個重要指標(biāo)。不同含水量的黃精種子在貯藏期間MDA含量的變化如圖5所示，由圖5可看出，種子的MDA含量呈現(xiàn)不斷升高的趨勢，含水量越高的種子，MDA含量上升的越快。15%含水量的種子MDA含量最高并且上升幅度最大，3%含水量的種子MDA含量最低，上升幅度最小。因此，種子含水量越高，在貯藏期間膜脂過氧化程度也越高，種子劣變越快。

圖5 含水量對黃精種子丙二醛（MDA）含量的影響

2.6 含水量對黃精種子發(fā)芽率的影響

圖6 含水量對黃精種子發(fā)芽率的影響

發(fā)芽率是衡量種子活力的最重要的指標(biāo)。鄭光華［12］曾經(jīng)將種子活力定義為種子的健壯度，其中最重要的一項就是種子迅速萌發(fā)的發(fā)芽潛力。不同含水量的黃精種子在貯藏期間發(fā)芽率的變化如圖6所示，由圖6可看出，貯藏5個月后，不同含水量的黃精種子發(fā)芽率均下降，15%含水量的種子在貯藏第1個月時發(fā)芽率達到最高，這可能與黃精種子自身生物學(xué)特性有關(guān)，在貯藏初期，含水量較高時種子內(nèi)部代謝比較活躍，同時降低了種子中的內(nèi)源抑制物質(zhì)的活性，所以在開始貯藏期間其發(fā)芽率較其他種子高。貯藏5個月后，3%含水量的黃精種子仍能保持高于70%的發(fā)芽率，15%含水量的種子發(fā)芽率降低到40%以下，可見，低含水量有利于黃精種子保持較高的發(fā)芽能力。

2.7 含水量對黃精種子可溶性糖含量的影響

種子貯藏物質(zhì)是維持種子活力和種子壽命的營養(yǎng)基礎(chǔ)。種子在貯藏過程中，其貯藏物質(zhì)會經(jīng)歷一個動態(tài)的變化過程，這與種子的自身的代謝活動密切相關(guān)［13］。而貯藏物質(zhì)的含量變化與貯藏的條件也有很大的關(guān)系。不同含水量黃精種子在貯藏期間可溶性糖、可溶性蛋白及粗脂肪含量均有不同程度的變化。

可溶性糖是種子在貯藏過程中呼吸代謝的最主要的底物［14］，其含量在種子貯藏過程中的變化很復(fù)雜。由圖7可看出：4種不同含水量的種子可溶性糖含量在貯藏期間，15%和10%含水量種子可溶性糖含量先升高再降低，在貯藏第3個月時可溶性糖含量達到最高，7%和3%含水量的種子可溶性糖含量先降低后升高，但是降低和升高幅度都很小，這說明，含水量低的種子在貯藏過程中呼吸代謝活動弱。15%含水量種子的可溶性糖含量顯著高于其他含水量的種子，7%和3%含水量的種子可溶性含量差異不顯著。

圖7 含水量對黃精種子可溶性糖含量的影響

2.8 含水量對黃精種子可溶性蛋白的影響

種子的活力與蛋白合成有關(guān)，隨著貯藏時間的延長，蛋白質(zhì)和酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，蛋白質(zhì)的合成減少，種子活力降低。種子的貯藏蛋白含量與脫水敏感性和環(huán)境脅迫有關(guān)，如人工老化和貯藏溫度等［15－16］?？扇苄缘鞍缀孔兓涸谫A藏期內(nèi)，隨著貯藏時間的延長，不同含水量黃精種子的蛋白質(zhì)含量均呈下降趨勢，含水量越低，下降幅度越小（圖8）。15%和10%含水量種子下降幅度較快，3%含水量的種子可溶性蛋白含量降低最慢，含量略高于7%的種子。在同一時期，總的表現(xiàn)是：隨含水量的降低，黃精種子蛋白質(zhì)含量逐漸增加。表明低含水量能夠保持黃精種子中蛋白質(zhì)和酶結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，進而延長種子壽命。

圖8 含水量對黃精種子可溶性蛋白的影響

2.9 含水量對黃精種子粗脂肪含量的影響

脂肪是種子主要的貯藏物質(zhì)之一。種子萌發(fā)時，脂肪在脂肪酶的作用下分解成為甘油和脂肪酸，進一步轉(zhuǎn)化為糖類供胚利用［17］。種子中的不飽和脂肪酸的氧化會形成自由基，引起膜脂過氧化反應(yīng)，并且產(chǎn)生丙二醛，進一步對膜系統(tǒng)造成損傷，導(dǎo)致種子活力下降［16］。由圖9可看出，在貯藏期內(nèi)，不同含水量的黃精種子粗脂肪含量均降低。從貯藏第3個月開始，15%和10%含水量的種子粗脂肪含量明顯低于7%和3%含水量的種子。15%含水量的種子粗脂肪含量低于10%的種子。3%和7%含水量的種子在貯藏5個月內(nèi)粗脂肪都能保持較高的含量。

圖9 含水量對黃精種子粗脂肪含量的影響

3 結(jié)論與討論

3%含水量的黃精種子在貯藏過程中各抗氧化酶（CAT、SOD、POD）能保持較高的活性，并且自身代謝緩慢，對貯藏物質(zhì)利用量小，產(chǎn)生自由基量小，MDA含量低，對種子的細胞膜系統(tǒng)有很好的保護，種子老化劣變進程緩慢，使種子能保持較高的活力。

種子的優(yōu)劣是植株健壯與否的首要條件，種子從收獲到播種都要經(jīng)過或長或短的貯藏期，貯藏條件直接影響種子的生活力［18］。通常，種子在貯藏過程中，種子活力會隨著貯藏時間的延長而逐漸下降，但是由于不同的含水量的影響，種子活力會呈現(xiàn)不同的變化。膜系統(tǒng)的破壞損傷是種子發(fā)生劣變的根本原因［19］。

超干貯藏是種子貯藏領(lǐng)域的一個重要方法，早在1991年就被列入國家“八五”重點攻關(guān)項目［6］。超干貯藏就是將種子含水量降至5%以下，密封后室溫貯藏。近年來，種子超干貯藏生理的報道很多，包括紅花、油松、當(dāng)歸、新麥草、水稻等不同類型的種子，均表明將種子超干處理可以有效保持種子活力，減緩種子劣變進程［20－24］。本研究將黃精種子含水量降至3%，隨著貯藏時間的延長，其活力未有明顯的降低，抗氧化酶活性（包括CAT、SOD、POD）明顯高于7%、10%和15%含水量處理的黃精種子，MDA含量和相對電導(dǎo)率低且上升緩慢。15%含水量的種子相對3%、7%和10%含水量的種子抗氧化酶活性下降迅速，MDA含量和電導(dǎo)率上升最快。這說明高含水量的黃精種子膜系統(tǒng)破壞很嚴重，加快種子劣變進程，也會導(dǎo)致種子發(fā)芽率的下降。3%含水量的黃精種子在貯藏5個月后發(fā)芽率為72.5%，而15%含水量的黃精種子發(fā)芽率為33.2%，遠遠小于3%含水量的種子。另外，3%含水量的黃精種子可溶性糖含量相對穩(wěn)定，可溶性蛋白含量和粗脂肪含量下降速度較其他含水量種子慢。這是因為含水量越低的種子，其內(nèi)部代謝活動越緩慢，對種子的營養(yǎng)物質(zhì)的消耗也越少，產(chǎn)生的自由基少，膜系統(tǒng)能得到很好的保護，種子劣變也越緩慢。

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