王欣欣， 盧 萍， 李鴻雁， 黃 帆， 李 俊

（1.內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 呼和浩特010022；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所， 內(nèi)蒙古 呼和浩特010010）

老芒麥（Elymus sibiricus L.）別名西伯利亞披堿草，是禾本科（Gramineae）小麥族（Triticeae）披堿草屬（Elymus）優(yōu)質(zhì)牧草［1］。主要分布在北半球溫帶地區(qū)，集中在東歐、西伯利亞、俄羅斯、中亞、西亞、蒙古、朝鮮、日本及印度，在我國(guó)野生老芒麥資源主要分布于東北、內(nèi)蒙古、甘肅、寧夏、青海、新疆、四川、西藏、河北、山西、陜西、等省區(qū)［2］。老芒麥等野生披堿草屬植物適應(yīng)性強(qiáng)，具有耐鹽、抗寒和抗旱等特性［3］。老芒麥植株葉量豐富，其粗蛋白含量高，適口性好，利于消化，可以青飼和放牧，也可制成干草，為牲畜所喜食［4］。

目前世界上已收集610萬(wàn)份植物種質(zhì)資源，約90%以種子形式保存在低溫種質(zhì)庫(kù)中［5－6］。種質(zhì)庫(kù)中種子的安全保存要確保種質(zhì)在更新及貯存過(guò)程中維持其遺傳完整性，開(kāi)展種質(zhì)遺傳完整性的變化研究非常重要。

近年來(lái)，醇溶蛋白電泳技術(shù)廣泛應(yīng)用于牧草種質(zhì)資源遺傳完整性的研究分析，該技術(shù)簡(jiǎn)單易行、花費(fèi)少，不需精密儀器，多態(tài)性較好，適合大規(guī)模檢測(cè)老芒麥種質(zhì)遺傳完整性［7］。王芳等［8］采用醇溶蛋白電泳技術(shù)對(duì)20份大麥種質(zhì)進(jìn)行遺傳完整性分析，發(fā)現(xiàn)某些大麥異質(zhì)性種質(zhì)的遺傳完整性在繁殖更新過(guò)程中發(fā)生了變化。任守杰等［9］用醇溶蛋白電泳技術(shù)對(duì)20份小麥種質(zhì)遺傳完整性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)小麥更新時(shí)，較高發(fā)芽率是維持異質(zhì)性種質(zhì)遺傳完整性的關(guān)鍵因素。目前有關(guān)利用醇溶蛋白標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)老芒麥種質(zhì)資源遺傳完整性方面的研究少有報(bào)道。本研究用A－PAGE酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，對(duì)3種老化處理?xiàng)l件下、4份老芒麥材料的16份種子醇溶蛋白進(jìn)行分析，旨在從蛋白水平上探討其遺傳完整性變化，以期為牧草種質(zhì)資源的安全保存和種子的繁殖更新標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所國(guó)家牧草種質(zhì)中期庫(kù)提供，種質(zhì)材料在2012年7月收獲，保存于中期庫(kù)，貯存溫度（4±2）℃。

表1 試驗(yàn)材料及來(lái)源

1.2 老化方法

采用Delouche等提出的高溫（40℃）高濕（100%RH）老化法［10］對(duì)種子進(jìn)行處理，具體如下：濾紙置于干燥器中間白瓷板上，干燥器底部盛無(wú)菌水，將待處理種子以單層鋪于濾紙上，保證處理?xiàng)l件一致，蓋嚴(yán)干燥器，置40℃老化箱內(nèi)進(jìn)行高溫高濕老化處理，使其發(fā)芽率分別達(dá)到80%、50%和30%左右。

1.3 種子發(fā)芽率測(cè)定

參照牧草種子檢驗(yàn)規(guī)程［11］中老芒麥的標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽條件對(duì)材料進(jìn)行發(fā)芽實(shí)驗(yàn)，發(fā)芽床鋪2層濾紙，每天光照8h、黑暗16h，溫度設(shè)為25℃和15℃，第5天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)，第12天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，取平均值（見(jiàn)表2）。

1.4 研究方法

1.4.1 樣品提取

每份材料各取30粒種子，采用半粒種子法，方法如下：將種子橫切，帶胚端發(fā)芽，若發(fā)芽則提取另外半粒種子進(jìn)行貯藏蛋白分析；不發(fā)芽者剔除。取與發(fā)芽相對(duì)半粒種子0.2g，將樣品磨碎，放入1.5mL離心管中，按1mg加入6μL的比例加入樣品提取液（提前配好：25mL乙二醇＋0.05g甲基綠，用無(wú)離子水定容至100mL，－4℃低溫保存），在振蕩器振蕩混勻，于室溫下浸提過(guò)夜，使用前10 000r／min離心10min，取上清液點(diǎn)樣。

1.4.2 A－PAGE分析

參照國(guó)際種子檢查協(xié)會(huì)ISTA標(biāo)準(zhǔn)程序（1986年）進(jìn)行種子醇溶蛋白提?。?2］。取適量凝膠溶液，按凝膠溶液1mL加入1μL 10%過(guò)硫酸銨，1μL TEMED，迅速搖勻。灌膠，插好樣品梳，讓其在5～10 min內(nèi)聚合。醇溶蛋白的進(jìn)樣量為10～15μL，將電壓調(diào)至200V，電泳20min，電泳在4℃冰箱中進(jìn)行，將電壓調(diào)至500V，待甲基綠沿指示劑遷移至底板2cm處，再將電壓調(diào)為400V，指示劑遷移至凝膠前沿時(shí)，結(jié)束電泳。凝膠加1%考馬斯亮藍(lán)5mL，加10%三氯乙酸200mL染色過(guò)夜。在7%醋酸中保存，拍照。

1.5 數(shù)據(jù)處理

按條帶有無(wú)分別賦值，有記為1，無(wú)記為0，計(jì)算相似系數(shù)S＝2Nab／（Na＋Nb）×100%（Na，Nb，Nab分別代表a、b和ab的酶帶數(shù)），再應(yīng)用POP－GENE 32軟件進(jìn)行醇溶蛋白電泳譜帶差異和遺傳多樣性指數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析［13－14］。采用 NTSYSpc 2.1軟件進(jìn)行聚類 分析［15－16］。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工老化后老芒麥種子的相對(duì)發(fā)芽率

表2 人工老化處理對(duì)老芒麥種子相對(duì)發(fā)芽率的影響

表3 16份老芒麥種質(zhì)醇溶蛋白相似性系數(shù)

2.2 醇溶蛋白譜帶分析

16份種質(zhì)材料共檢測(cè)出18條醇溶蛋白條帶，均為多態(tài)性條帶（見(jiàn)圖1）。每1份材料具有其特有的醇溶蛋白指紋圖譜，其中E 1條帶最多，為9條，老化后發(fā)芽率降至30%的E 4條帶最少，為4條，平均每份種質(zhì)檢測(cè)到7.3條。依照蛋白質(zhì)的分子量由小到大，遷移率由快到慢將醇溶蛋白電泳圖譜分為4個(gè)區(qū)，即α、β、γ和ω區(qū)。隨高溫高濕老化時(shí)間延長(zhǎng)，種子生活力不斷下降。4個(gè)種質(zhì)以3種老化條件處理后，各分區(qū)中譜帶數(shù)目有的不同。

圖1 老芒麥種子醇溶蛋白電泳圖譜

當(dāng)老化處理使發(fā)芽率降至50%左右時(shí)，醇溶蛋白圖譜顏色逐漸變淺，隨著老化時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，發(fā)芽率降到30%左右，α、β區(qū)的醇溶蛋白有的譜帶表現(xiàn)為消失。

2.3 醇溶蛋白相似性系數(shù)

老芒麥醇溶蛋白條帶相似性系數(shù)見(jiàn)表3，老化處理后E 1的4個(gè)材料的種質(zhì)相似性系數(shù)在0.94和1.00間；E 2的4個(gè)材料的相似性系數(shù)在0.85和1.00間；E 3的相似性系數(shù)在0.85與1.00間；E 4的相似性系數(shù)在0.72和1.00間，其中 E 1－0和 E 1－1，E 1－2和E 1－3，E 2－0 和 E 2－1，E 2－0和 E 3－1，E 2－1和 E 3－1，E 2－3和 E 3－2，E 2－0和 E 3－3，E 2－1和 E 3－3，E 3－1和E 3－3，E 4－0和E 4－1材料間的相似系數(shù)為1.00，說(shuō)明親緣關(guān)系最近；E 2－0和E 4－3，E 2－1和E 4－3，E 3－1和E 4－3，E 3－3和E 4－3材料間的相似系數(shù)最小，為0.50，說(shuō)明親緣關(guān)系相對(duì)遠(yuǎn)些；老化后發(fā)芽率降至50%左右后，相似系數(shù)較未老化的種質(zhì)發(fā)生很大變化，種質(zhì)間存在較大的遺傳差異，遺傳組成上發(fā)生了變化。

2.4 醇溶蛋白遺傳參數(shù)分析

表4 老芒麥材料間的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、多樣性指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)

從表4可以看出，4份老芒麥種質(zhì)4個(gè)不同發(fā)芽率群體的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei’s基因多樣性、Shannon多樣性指數(shù)、多態(tài)性位點(diǎn)百分?jǐn)?shù)這5個(gè)指標(biāo)均隨著發(fā)芽率的下降而呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，這初步說(shuō)明隨老化程度的加大，低發(fā)芽率的老芒麥種質(zhì)對(duì)其遺傳完整性產(chǎn)生不利的影響。

2.5 聚類分析

老芒麥醇溶蛋白聚類分析結(jié)果見(jiàn)圖2，將材料劃分為三大類，其中第1類包括 E 4－2和 E 4－3號(hào)材料，來(lái)自E 4發(fā)芽率為54%和30%的2個(gè)梯度種質(zhì)；第2類包括 E 4－0和E 4－1號(hào)材料，來(lái)自E 4發(fā)芽率91%和81%的2個(gè)梯度種質(zhì)；第3類包括E 1－0、E 1－1、E 1－2、E 1－3、E 2－0、E 2－1、E 3－1、E 3－3、E 2－2、E 2－3、E 3－2和E 3－0號(hào)材料，其中E 1－0、E 1－1、E 1－2、E 1－3號(hào)材料為E 1種質(zhì)，E 2－0、E 2－1、E 2－2、E 2－3號(hào)材料為E 2種質(zhì)，E 3－0、E 3－1、E 3－2、E 3－3為E 3種質(zhì)。由此看出，來(lái)源相同的種質(zhì)材料部分聚在一起，呈現(xiàn)出規(guī)律性，即同一種質(zhì)不同的老化處理材料先聚一起，如來(lái)自E 1和E 4的材料各自聚為一類。但E 2和E 3的材料出現(xiàn)交叉，原因可能與老化后的種質(zhì)遺傳完整性改變有關(guān)。

圖2 基于醇溶蛋白圖譜的老芒麥種質(zhì)材料聚類圖

E 4的4個(gè)材料間聚類分析見(jiàn)圖3，劃分為兩大類，發(fā)芽率為91%的群體（對(duì)照）和81%的群體為一類；發(fā)芽率54%的群體和30%的群體聚為一大類。說(shuō)明老化后群體內(nèi)的某些醇溶蛋白基因序列可能改變或消失，同時(shí)表明低發(fā)芽率種質(zhì)資源不利于遺傳完整性的保持。

圖3 03658老芒麥基于種子醇溶蛋白的聚類圖

3 討 論

譚富娟等對(duì)燕麥種子貯存后遺傳完整性的研究分析發(fā)現(xiàn)，不同貯存年代種子的酯酶、淀粉酶、過(guò)氧化物酶、同工酶和醇溶蛋白圖譜中陳舊材料的條帶數(shù)明顯減少、顏色變淺［17］。張晗等對(duì)大麥地方品種普乃干木進(jìn)行醇溶蛋白譜帶分析，發(fā)現(xiàn)發(fā)芽率降到34%時(shí)，白帶型Ⅲ生物型隨之消失［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)高溫高濕老化處理后，老芒麥種子發(fā)芽率降至50%左右時(shí)種子醇溶蛋白圖譜有條帶顏色變淺，有的消失，同一種質(zhì)不同老化處理、不同發(fā)芽率材料間的相似系數(shù)出現(xiàn)變化，與上述研究的結(jié)論相同。

人工老化處理的低發(fā)芽率種質(zhì)群體的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei’s基因多樣性、Shannon多樣性指數(shù)、多態(tài)性位點(diǎn)百分?jǐn)?shù)的參數(shù)值，較對(duì)照種質(zhì)的數(shù)值有所下降，說(shuō)明老化后種子活力降低，某些醇溶蛋白基因的DNA序列改變或丟失，對(duì)其遺傳完整性維持產(chǎn)生不利影響。這與任守杰［9］、張晗［19］和王小麗［20］等對(duì)20份小麥種質(zhì)、不同發(fā)芽率水平玉米和扁蓿豆的研究結(jié)果相似。

聚類分析發(fā)現(xiàn)，低發(fā)芽率E 4種質(zhì)（54%的群體和30%群體）聚為一類，發(fā)芽率為91%的群體（對(duì)照）和81%的群體為一類，種質(zhì)老化后群體內(nèi)出現(xiàn)遺傳變異，某些序列可能改變或丟失，老化后無(wú)法聚在一起；同一種質(zhì)E 1和E 4不同的老化處理的材料，先聚一起，也有部分材料有分支，可能受到老化處理的影響使其發(fā)生了突變。另外，老芒麥?zhǔn)浅．惢ㄊ诜壑参铮s交使基因型發(fā)生了改變。

醇溶蛋白標(biāo)記是檢測(cè)植物多態(tài)性較好的技術(shù)手段，只能反映基因編碼區(qū)的部分變異，今后可以結(jié)合其它標(biāo)記技術(shù)，如形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記及DNA分子標(biāo)記（AFLP、SNP、SSR、ISSR）等進(jìn)行全面分析，以求準(zhǔn)確反映種子老化對(duì)其遺傳完整性的影響。

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各類文獻(xiàn)規(guī)范數(shù)據(jù)選項(xiàng)表