王 閃， 鄭禹軒， 劉冬杪， 張彩云， 張飛雄

（首都師范大學生命科學學院， 北京100048）

熱休克蛋白90（heat shock protein 90，Hsp 90）是在真核和原核細胞中都普遍存在的一組高度保守的分子伴侶，能對細胞中眾多信號蛋白的構象成熟、功能穩(wěn)定［1］及向細胞器的轉運等過程進行調控［2］。近些年研究發(fā)現(xiàn)，Hsp 90在細胞惡性轉化和轉移［3，4］、參與異染色質區(qū)的基因沉默調控［5］等方面都發(fā)揮著重要的作用，已成為新型的抗腫瘤藥物作用靶點［6］。為了探討Hsp 90作用的機理，眾多Hsp 90的抑制劑也逐漸被發(fā)現(xiàn)。Hsp 90抑制劑按照結合位點的不同可大體分為N－末端抑制劑、C－末端抑制劑以及結合位點未明確的抑制劑三大類［1］。

格爾德霉素（geldanamycin，GDA）最初是從吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）中分離得到的天然產(chǎn)物，是第一個被發(fā)現(xiàn)的Hsp 90N－末端抑制劑，屬于苯醌安莎類抗生素，體外具有抗病原蟲以及很好的抗腫瘤活性［7］。格爾德霉素通過競爭性結合Hsp 90N－末端的ATP／ADP結合位點，改變Hsp 90構象，使其不能與效應蛋白及其他小分子蛋白形成復合體，從而抑制其行使正常的功能并最終導致細胞的凋亡及細胞周期的停滯［8］，可作為生化調節(jié)劑應用于腫瘤聯(lián)合化療［9］。然而這些結論大部分是以動物和人為對象研究獲得的。有證據(jù)表明，GDA也會影響到植物的生長、形態(tài)發(fā)生等方面［10］，因此本研究選取小麥為實驗對象。

隨機擴增多態(tài)性 DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）是在PCR基礎上建立的以一系列隨機排列順序的寡聚核苷酸單鏈為引物對所研究的基因組DNA進行多態(tài)性分析的分子技術。它能較好地反映基因組相應區(qū)域的DNA多態(tài)性，具有快速、準確、多態(tài)性 檢 出 率 高 等 特 點［11，12］，在 分 類 學［13］、遺 傳 育種［14］等研究中都發(fā)揮著重要作用。

雙限制性內切酶酶切－隨機擴增技術（Coupled Restriction EnzymeDigestion－Random Amplification，CRED－RA）是在RAPD技術的基礎上，利用HpaII與MspI對同一識別位點間敏感性不同，通過分析HpaII－MspI作用后的電泳譜帶的差異來檢測DNA的甲基化修飾［15］，該技術被廣泛應用于DNA甲基化的檢測以及遺傳連鎖圖譜的構建等方面［16］。

本實驗以小麥為材料，經(jīng)GDA處理后發(fā)現(xiàn)根的生長受到抑制，在此基礎上運用RAPD和CRED－RA從分子水平上對其作用機制進行了探討。

1 材料和方法

1.1 實驗材料及GDA處理

實驗材料為普通小麥（Triticum aestivumL.）品種CB 037－A。選取大小相近、顆粒飽滿的小麥種子用自來水浸泡吸脹1h后，放到鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，于23℃下避光過夜萌發(fā)。將萌發(fā)露白的種子用150μmol／L GDA（Selleckchem 公司產(chǎn)品，DMSO 溶解配制）溶液避光處理24h；對照組用自來水處理相同時間。

1.2 DNA提取及RAPD和CRED－RA分析

1.2.1 DNA提取

植物基因組DNA提取試劑盒購于康為世紀（CW 0553）并按照說明書步驟提取小麥根尖細胞基因組總DNA（gDNA），于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RAPD分析

本 次 實 驗 使 用 的 引 物 為 OPA－05、OPA－10、OPD－08、OPJ－01、OPK－08、OPO－05、A.z 09、S 32、S 126、S 127，由上海生工合成（序列見表1）。

PCR反應體系：10×PCR 緩沖液 （含 Mg2＋）2μL，dNTP混合液0.2μL，Taq酶1U，10bp隨機引物20pmol，DNA 模板15ng，用 Milli Q 水補齊至20μL。

PCR反應程序：94℃預變性5min，再以94℃變性1min、36℃退火1min、72℃延伸2min，共循環(huán)45次，最后72℃再延伸10min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用Takara公司的500bp DNA分子量標準，以Bio－Rad公司的電泳成像系統(tǒng)檢測拍照。

1.2.3 CRED－RA分析

取1μg gDNA分別用1μL HpaII和1μL MspI于37℃酶切2h。然后使用艾德萊公司生產(chǎn)的DNA純化試劑盒（DR 02）將酶切產(chǎn)物純化。PCR體系、反應程序及所用引物均與RAPD的分析相同。

表1 用于RAPD與CRED－RA分析的隨機引物序列

2 結果與分析

2.1 GDA處理對小麥根生長的影響

圖1是150μmol／L GDA處理24h后小麥根尖生長的照片，可以看出，處理組根的長度不到對照組的一半，很顯然小麥根的生長受到嚴重抑制。

圖1 GDA處理后小麥根尖的生長狀況

2.2 GDA處理導致gDNA的多態(tài)性增加

gDNA的多態(tài)性包括條帶的增加和減少、亮度的變化等差別［17－18］。

10種隨機引物的擴增結果顯示，對照組gDNA共擴增出53條帶，處理組條帶數(shù)目增加了2條，分別由OPA－05、OPK－08兩個引物擴增出；沒有條帶數(shù)目減少的情況發(fā)生（表2，圖2）。與此同時，條帶明亮程度出現(xiàn)差異，表現(xiàn)在引物OPA－05擴增后有4條帶變亮；而OPK－08的擴增產(chǎn)物有1條帶變暗（表3，圖2）。

圖2 GDA處理的小麥根尖細胞基因組DNA以S 127、OPA－05和OPK－08為引物的RAPD電泳圖譜

總體而言，GDA處理后，小麥gDNA有7條多態(tài)性差異。

表2 小麥根端細胞經(jīng)150μmol／L GDA處理后的RAPD條帶與對照組相比條帶數(shù)目的變化

2.3 GDA處理引起DNA甲基化增加

比較對照組與處理組CRED－RA電泳圖，發(fā)現(xiàn)存在有2種類型的條帶（1，2）變化現(xiàn)象（圖3）。OPA－05擴增條帶中具有類型1的變化，表明經(jīng)150μmol／L GDA處理后，DNA能被MspI切割，不能被HpaII切割；而對照組DNA兩種酶都能切割，說明此處本沒有甲基化的DNA轉變成了內部甲基化修飾。S 32的擴增產(chǎn)物中出現(xiàn)類型2的變化，表明經(jīng)處理后DNA只可被MspI所切割，不能被HpaII切割；而對照組DNA這兩種酶都不能切割，說明在這一區(qū)域DNA由原來的外部甲基化修飾轉變?yōu)閮炔考谆揎棥?/p>

表3 小麥根端細胞經(jīng)150μmol／LGDA處理后的RAPD條帶與對照組相比條帶明暗的變化

實驗結果表明，經(jīng)GDA處理后的小麥根尖細胞基因組DNA甲基化水平有所增加。

3 討 論

早前有關GDA調節(jié)生物生長、發(fā)育、基因表達和凋亡等作用多是在動物和人中研究獲得的，該抑制劑在植物中的作用報道很少。Kozeko的研究結果顯示，GDA能抑制擬南芥幼苗的生長和形態(tài)學發(fā)生［10］。

本實驗用150μmol／L GDA溶液處理萌發(fā)的小麥根尖，證實根的生長確實受到抑制。為了探討其作用機制，應用RAPD和CRED－RA方法進行了檢測，結果表明，GDA處理后小麥基因組DNA有7條的多態(tài)性差異；同時出現(xiàn)了2種類型的DNA甲基化修飾現(xiàn)象，它們分別說明原先沒有甲基化的DNA轉變成了內部甲基化修飾，原先為外部甲基化修飾的DNA轉變成了內部甲基化修飾。由于DNA的甲基化修飾會導致產(chǎn)生沉默基因，抑制其轉錄活性［19］，因此GDA處理后小麥根尖的生長受到抑制就不難理解了。

本研究首次從分子水平和表觀遺傳學水平上揭示了GDA導致植物生長受到抑制的作用機理。

圖3 以 OPA－05、S 32作為引物的CRED－RA電泳圖譜

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