胡利莎 張 振 馬培振 王海艷①

(1. 中國科學(xué)院海洋研究所 青島 266071; 2. 中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049; 3. 中國海洋大學(xué) 青島 266003)

菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)屬于軟體動物門(Mollusca), 雙殼綱(Bivalvia), 簾蛤目(Venerioda), 簾蛤科(Veneridae), 蛤仔屬(Ruditapes)。菲律賓蛤仔分布于俄羅斯、日本、菲律賓和中國沿海,在我國河北、山東、浙江、福建、廣東等省區(qū)沿海分布較廣。菲律賓蛤仔生長迅速, 適應(yīng)性強, 肉味鮮,是我國4大養(yǎng)殖貝類之一, 具有較高的經(jīng)濟價值。近些年來, 我國菲律賓蛤仔的人工養(yǎng)殖規(guī)模快速發(fā)展,異地引種養(yǎng)殖現(xiàn)象頻繁出現(xiàn), 這一人類活動使菲律賓蛤仔野生群體間的遺傳多樣性結(jié)構(gòu)受到了一定的影響, 因此, 研究我國菲律賓蛤仔的種群遺傳學(xué), 不僅能夠保護菲律賓蛤仔的種質(zhì)資源, 還能為菲律賓蛤仔養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展提供良好的生物學(xué)依據(jù)。

目前對菲律賓蛤仔種群遺傳學(xué)已有較多研究。裴贏等(2006)采用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)分析了大連沿海6個菲律賓蛤仔種群的遺傳多樣性及其分布, 結(jié)果表明該地區(qū)的菲律賓蛤仔種群具有較高的遺傳多樣性,且種群之間存在一定數(shù)量的遺傳變異。葛京盈等(2008)研究表明大連、丹東、青島和錦州4群體生化遺傳特征上未見明顯差異, 且4個野生群體的遺傳多樣性屬偏低水平。Bi等(2012)研究結(jié)果顯示煙臺和威海的菲律賓蛤仔無明顯的種群結(jié)構(gòu), 且具有較高的單倍型多樣性。Ren等(2006)利用同工酶的方法、李旭光等(2009)采用聚丙稀酰胺同工酶技術(shù)對菲律賓蛤仔不同群體遺傳特征進行了研究, 認為中國沿海菲律賓蛤仔分化成南、北兩大類群。Sekine等(2006)和Mao等(2011)利用COI基因的研究也得出類似的結(jié)果。

結(jié)合前人的研究結(jié)果可以看出, 關(guān)于北方菲律賓蛤仔的遺傳多樣性的研究結(jié)果各不相同。Ren等(2006)未對中國沿海南北兩大類群的遺傳多樣性進行詳細的分析。在此基礎(chǔ)上本研究將結(jié)合 COI和 16S rRNA兩種基因分析中國沿海菲律賓蛤仔的遺傳多樣性和系統(tǒng)進化關(guān)系, 為菲律賓蛤仔種群的遺傳結(jié)構(gòu)特征以及生物資源保護提供更加準(zhǔn)確的分子生物學(xué)信息。

1 材料與方法

1.1 材料與樣品制備

實驗所需樣品分別從大連、榮成、連云港、霞浦、莆田、廣州、陽江、湛江、欽州、儋州當(dāng)?shù)夭杉? 每群體個體數(shù)量為 12—23個, 樣品采集后立即用 95%酒精固定, 保存?zhèn)溆?。圖1為樣品采集地的分布。

圖1 菲律賓蛤仔樣品分布圖Fig.1 Map of sampling sites for R. philippinarum

1.2 DNA的提取、擴增及測序

取菲律賓蛤仔閉殼肌肌肉約 100mg充分剪碎,用TIANamp海洋動物DNA提取試劑盒(北京天根生物有限公司)提取全基因組。

線粒體COI基因擴增引物L(fēng)CO1490 (5′-GGTCA ACAAATCATAAAGATATTGG-3′)和 HCO2198 (5′-A AACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′) (Folmeret al, 1994); 16S rRNA基因擴增引物16S rRNAar (5′-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3′) 和 16S rRNAbr(5′-CCGGTCTGAACTCAGMTCAYG-3′) (Anderson,2000), 由上海桑尼生物科技有限公司合成。實驗中PCR 反應(yīng)體系: 2μL 10×PCR buffer, 1.5mM Mg2+,200μM dNTPs, 1U Taq DNA polymerase, 正、反向引物各 0.4μM, 2μL 模板 DNA 溶液(10–100ng/μL), 用超純水補充至 25μL。PCR擴增反應(yīng)程序為: 預(yù)變性94°C 5min; 94°C 30s, 48–52°C 1min, 72°C 1min, 循環(huán)30–35 次; 總延伸 72°C 10min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%–2.0%瓊脂糖電泳凝膠純化后送上海桑尼生物科技有限公司測序, COI基因測序引物用LCO1490, 16S rRNA基因測序引物用16S rRNar。

1.3 數(shù)據(jù)分析

單倍型: Haplotype, 指若干個決定同一性狀的緊密連鎖的基因構(gòu)成的基因型, 及一條染色體上 SNP基因型的組合。

DNA序列結(jié)果由CLUSTAL X軟件(Thompsonet al, 1997)采用默認參數(shù)對位, 并進一步經(jīng)人工校對。對位后將堿基序列輸入 DnaSP 5軟件(Rozasetal,2003)統(tǒng)計單倍型, 并統(tǒng)計單倍型在各采樣點的分布情況, 并對多態(tài)位點數(shù)、單倍型數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)、單倍型多樣性指數(shù)(Hd)、平均核苷酸差異數(shù)(K)等遺傳多樣性參數(shù)進行計算; 采用 Mega5.1(Tamuraetal, 2004)軟件進行遺傳距離計算和聚類分析, 并構(gòu)建NJ進化樹。采用IBDWS(Jensenetal, 2005)軟件中的 Mantel檢測評估菲律賓蛤仔群體的遺傳距離和地理距離的相關(guān)性。運用 ARLEQUIN v3.5(Excoffieretal, 2005)軟件中的分子變異分析(AMOVA)方法估算遺傳變異在群體內(nèi)和群體間的分布, 并計算群體間遺傳分化系數(shù)(F-statistics,Fst)及其顯著性(重復(fù)次數(shù)1000)。

2 結(jié)果

2.1 菲律賓蛤仔群體基因序列堿基組成

COI和16S rRNA基因序列通過BLAST 分析、比較確認, 經(jīng)CLUSTAL X同源排序, 除去引物和部分端序列, 分別得到長度為632bp和473bp的基因片段。利用Mega5.1軟件計算菲律賓蛤仔群體COI和16S rRNA基因序列堿基組成, 不同群體的各堿基組成基本一致,COI基因T、C、A、G、A+T和G+C的平均含量分別為41.4%, 12.8%, 23.4%, 22.3%, 64.8%, 35.2%, AT含量明顯高于GC含量。16S rRNA基因T、C、A、G、A+T和G+C的平均含量分別為33.0%, 10.6%, 33.6%, 22.8%,66.6%, 33.4%, AT含量亦明顯高于GC含量。

2.2 菲律賓蛤仔群體遺傳多樣性分析

利用DnaSP 5軟件計算群體遺傳多樣性參數(shù), 結(jié)果見表1和表2。根據(jù)COI基因序列計算遺傳多樣性參數(shù), 在183個菲律賓蛤仔個體中, 共檢測到67個單倍型, 且每個群體都具有各自的單倍型。群體特有單倍型50個, 占單倍型總數(shù)的74.63%; 共享單倍型17個, 占單倍型總數(shù)的25.37%, 其中共享單倍型Hap_4的個體數(shù)最多 31個, 占總個體數(shù)的 16.94%, 共享單倍型Hap_4在除大連群體和榮成群體外的8個群體中均有分布, 而Hap_16分布在大連群體和榮成群體中。COI基因共檢測到 126個核苷酸多態(tài)位點, 包括 83個單突變位點, 43個簡約信息位點, 總?cè)后w的平均核苷酸差異數(shù)為 6.35447, 核苷酸多樣性指數(shù)為0.01005。其中榮成群體遺傳多樣性參數(shù)較高, 莆田群體遺傳多樣性參數(shù)較低。

表1 基于COI基因序列片段的10個菲律賓蛤仔群體的遺傳多樣性參數(shù)Tab.1 Genetic diversity parameters of partial COI gene in 10 populations of R. philippinarum

表2 基于16S rRNA基因序列片段的10個菲律賓蛤仔群體的遺傳多樣性參數(shù)Tab.2 Genetic diversity parameters of partial 16S rRNA gene in 10 populations of R. philippinarum

根據(jù) 16S rRNA 基因序列計算遺傳多樣性參數(shù),在193個菲律賓蛤仔個體中, 共檢測到了22個單倍型, 群體特有單倍型15個, 占單倍型總數(shù)的68.18%,共享單倍型7個, 占單倍型總數(shù)的31.82%, 其中共享單倍型Hap_1個體數(shù)最多138, 占總個體數(shù)的71.50%,在10個群體中均有分布。共檢測到21個核苷酸多態(tài)位點, 包括14個單突變位點, 7個簡約信息位點, 總?cè)后w的平均核苷酸差異數(shù)為 0.86161, 核苷酸多樣性指數(shù)為 0.00182。其中榮成和大連群體遺傳多樣性參數(shù)普遍高于其余群體, 而霞浦群體因只有一種單倍型其遺傳多樣性參數(shù)為零。

2.3 菲律賓蛤仔群體的遺傳距離和聚類分析

利用Mega5.1所計算的群體內(nèi)、群體間遺傳距離如表3和4所示?；贑OI基因的計算結(jié)果: 榮成群體內(nèi)遺傳距離最高為0.014052, 而莆田群體內(nèi)遺傳距離最低為 0.005089, 說明榮成群體遺傳多樣性最高,莆田群體遺傳多樣性較低; 群體間遺傳距離在 0.005—0.021, 其中榮成群體和大連群體與其他群體的遺傳距離均較高; 榮成與其他群體間遺傳距離中與欽州群體的最高, 與大連群體的最低; 欽州和廣州、儋州、連云港、霞浦、莆田、湛江、陽江8個群體兩兩間的遺傳距離均低于與榮成和大連之間的遺傳距離?；?6S rRNA基因計算的結(jié)果: 榮成群體內(nèi)遺傳距離最高為0.002938, 而霞浦群體內(nèi)遺傳距離最低為0,說明榮成群體遺傳多樣性最高, 霞浦群體遺傳多樣性較低; 群體間遺傳距離在 0.000151—0.004378, 其中榮成群體和大連群體與其他群體的遺傳距離均較高; 榮成與其他群體間遺傳距離中與連云港群體的最高, 與大連群體的最低; 欽州和廣州、儋州、連云港、霞浦、莆田、湛江、陽江8個群體兩兩間的遺傳距離均低于與榮成和大連之間的遺傳距離。

利用 Mega5.1軟件中的 NJ法對菲律賓蛤仔 10個群體進行系統(tǒng)樹的構(gòu)建, 群體之間的系統(tǒng)聚類圖如圖2和3所示, 從圖中可以看出, 基于COI基因和16S rRNA基因構(gòu)建的NJ樹均分為兩大支, 大連、榮成群體聚為一支, 其余8個群體聚為一支。

對菲律賓蛤仔10個群體進行地理距離和遺傳距離的 Mantel測試, 發(fā)現(xiàn)菲律賓蛤仔群體的遺傳距離與地理距離之間不存在明顯的線性關(guān)系(COI基因:R=0.5430,P=0.9874; 16S rRNA 基因:R=0.6395,P=0.9956)(圖 4、圖 5)。

2.4 菲律賓蛤仔群體的遺傳分化

運用ARLEQUIN v3.5計算的群體間遺傳分化系數(shù)(Fst)及其顯著性如表3和表4所示。由表3可看出,基于COI基因所得出的10個群體間的遺傳分化指數(shù)在–0.03146—0.49684之間, 其中湛江與莆田之間的遺傳分化系數(shù)最小, 大連與莆田之間的遺傳分化系數(shù)最大。群體間兩兩比對的組中, 18個組間的遺傳分化表現(xiàn)為差異不顯著(P＞0.05), 10個組表現(xiàn)為顯著差異(P＜0.05), 17個組表現(xiàn)為極顯著差異(P＜0.01), 除大連和榮成群體外的其他群體相互之間均未達到分化極顯著(除霞浦與廣州群體間的遺傳分化極顯著外)。由表4可看出, 基于16S rRNA基因所得出的10個群體間的遺傳分化指數(shù)在–0.04027—0.63743之間, 其中榮成與霞浦之間的遺傳分化指數(shù)最大, 榮成與大連之間的遺傳分化指數(shù)最小。群體間兩兩比對的組中,22個組間的Fst值統(tǒng)計檢驗結(jié)果為差異不顯著(P＞0.05), 4個組為差異顯著(P＜0.05), 19個組表現(xiàn)為差異極顯著(P＜0.01), 連云港群體與欽州、儋州、霞浦、湛江群體間的遺傳分化顯著, 與其余群體極顯著;結(jié)合COI基因和16S rRNA基因總體來看, 榮成群體除與大連群體間的遺傳分化差異不顯著外, 與其他群體間的遺傳分化均為極顯著, 并且大連群體也是除與榮成群體間的遺傳分化不顯著外, 與其他群體間的遺傳分化均為極顯著; 群體間遺傳分化顯著或者是極顯著的均出現(xiàn)在榮成群體、大連群體、連云港群體與其他群體之間。按照 NJ樹的分組, 將榮成群體和大連群體分為一組, 其余8個群體分為一組進行Fst分析, 結(jié)果顯示基于COI基因和16S rRNA基因組群間的遺傳分化指數(shù)分別為 0.05615, 差異極顯著(P＜0.01)和 0.37253, 差異極顯著(P＜0.01)。

表3 基于COI基因序列片段的菲律賓蛤仔群體間遺傳距離(對角線下), 群體內(nèi)遺傳距離(粗線顯示)和群體間分化系數(shù)(對角線上)Tab.3 Genetic distances between populations (below the diagonal), genetic distances within populations (in bold values) and pairwise Fst (above the diagonal) of 10 populations of R. philippinarum based on partial COI gene

表4 基于16S rRNA基因序列片段的菲律賓蛤仔群體間遺傳距離(對角線下), 群體內(nèi)遺傳距離(粗線顯示)和群體間分化系數(shù)(對角線上)Tab.4 Genetic distances between populations (below the diagonal), genetic distances within populations (in bold values) and pairwise Fst (above the diagonal) of 10 populations of R. philippinarum based on partial 16S rRNA gene

圖2 基于COI基因菲律賓蛤仔10個群體的NJ樹Fig.2 NJ tree based on the COI gene of 10 populations of R.philippinarum

圖3 基于16S rRNA基因菲律賓蛤仔10個群體的NJ樹Fig.3 NJ tree based on the 16S rRNA of 10 populations of R.philippinarum

圖4 菲律賓蛤仔COI基因的遺傳距離模式(IBD)分析Fig.4 IBD analysis based on COI gene of R. philippinarum

圖5 菲律賓蛤仔16S rRNA基因的遺傳距離模式(IBD)分析Fig.5 IBD analysis based on the 16S rRNA of R. philippinarum

對菲律賓蛤仔10個群體進行AMOVA分析(如表5和6)表明, 基于COI基因群體內(nèi)遺傳變異為78.17%,群體間的遺傳變異為21.83%, 基于16S rRNA基因群體內(nèi)遺傳變異為 66.86%, 群體間的遺傳變異為33.14%, 說明菲律賓蛤仔群體遺傳分化主要表現(xiàn)為群體內(nèi)分化, 群體內(nèi)部遺傳多態(tài)性較高, 而在Fst分析中, 一般認為 0＜Fst＜0.05表示群體間無顯著分化,0.05＜Fst＜0.15 表示群體間的分化程度中等,0.15＜Fst＜0.25 表示群體間的分化程度較大,Fst＞0.25表示群體間的分化程度極大, 基于COI基因和16S rRNA基因菲律賓蛤仔群體總的遺傳分化指數(shù)分別為0.21828和0.33143, 說明菲律賓蛤仔群體間存在較大的遺傳分化。

表5 基于COI基因序列片段的菲律賓蛤仔群體遺傳變異的AMOVA分析Tab.5 Results of hierarchical AMOVA based on the partial COI sequences of 10 populations of R. philippinarum

表6 基于16S rRNA基因序列片段的菲律賓蛤仔群體遺傳變異的AMOVA分析Tab.6 Results of hierarchical AMOVA analysis based on the partial 16S rRNA sequences of the ten populations of R.philippinarum

3 討論

線粒體基因是群體遺傳學(xué)和進化生物學(xué)研究中的重要分子標(biāo)記。線粒體基因上的不同片段具有不同的解析能力, 即使是同一基因在不同的物種間的解析能力也是不同的。一般而言, 16S rRNA和COI基因在同一種群中變異程度較低, 但在不同的種群之間16S rRNA基因較COI基因具有明顯的保守性。本研究中菲律賓蛤仔10個群體16S rRNA和COI基因片段檢測到的多態(tài)位點數(shù)分別為126和21, 核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)分別為0.01005和0.00182, 此結(jié)果說明菲律賓蛤仔的不同的群體之間16S rRNA基因較COI基因具有明顯的保守性。

3.1 菲律賓蛤仔16S rRNA和COI基因的堿基組成和遺傳多樣性

本研究得到的10個菲律賓蛤仔群體的COI和16S rRNA兩個基因片段各堿基組成基本一致, A+T平均含量分別為64.8%、66.6%, G+C平均含量35.2%、33.4%, 所有群體的A+T含量均顯著高于G+C含量,這與其他貝類如文蛤?qū)?文蛤、麗文蛤等)、泥蚶、太平洋牡蠣等線粒體基因的堿基組成相一致(Kongetal,2001; 潘寶平等, 2006; 鄭文娟等, 2009)。

菲律賓蛤仔10個群體16S rRNA和COI基因片段單倍型多樣性(Hd)分別為0.47674和0.941, 核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)分別為0.00182和0.01005, 與相近物種相比: 例如櫛孔扇貝(Chlamys farreri)(劉亞軍等,2002)、泥蚶(Tegillarca granosa)(鄭文娟等, 2009)、光滑河籃(Potamocorbula laevis) (孫超等, 2013)、黑龍江河籃蛤(Potamocorbula amurensis)(孫超, 2013)、櫛江珧(Atrina pectinta)(嚴(yán)加坤等, 2013)、厚殼貽貝(Mytilis coruscus)(楊振雄等, 2014), 表明我國沿海菲律賓蛤仔遺傳多樣性相對比較豐富, 大連群體遺傳多樣性較高, 裴贏等(2006)的研究結(jié)果也表明大連群體具有較高的遺傳多樣性。

3.2 菲律賓蛤仔的遺傳距離和遺傳分化

菲律賓蛤仔遺傳參數(shù)Fst的 AMOVA分析表明:菲律賓蛤仔的遺傳分化主要來自群體內(nèi)(COI基因群體內(nèi)變異貢獻率為78.17%, 16S rRNA群體內(nèi)變異貢獻率為 66.86%), 說明群體內(nèi)的遺傳多態(tài)性較高; 另外, 依據(jù)各個群體間的 Fst分析, 榮成和大連群體間分化不顯著, 而榮成、大連群體與其余8個群體間分化達到極顯著水平(P＜0.01)。根據(jù)遺傳距離和遺傳樹的構(gòu)建將菲律賓蛤仔 10個群體分為兩組: 榮成群體和大連群體為一組, 其余8群體為一組, 基于兩組進行的分析表明: 兩組群間的遺傳分化極顯著, 因此可將我國沿海的菲律賓蛤仔分為南北兩個類群, Ren等(2006)、李旭光等(2009)的研究結(jié)果也將我國沿海菲律賓蛤仔群體分為南北兩個類群。

群體之間的遺傳距離能反映群體間的親緣關(guān)系。本研究結(jié)果表明榮成群體和大連群體與其他群體的遺傳距離較遠, 而其他群體間遺傳距離較近, 所以榮成群體和大連群體親緣關(guān)系較近, 其他8群體親緣關(guān)系較近。親緣關(guān)系的遠近一般與地理位置遠近一致,本研究中遺傳距離與地理距離沒有明顯的相關(guān)性。如連云港群體沒有與地理位置較近的榮成群體聚在一起, 反而與地理位置較遠的南方群體聚在一起, 可能是越來越多的南方菲律賓蛤仔苗種被引入北方養(yǎng)殖,使得連云港本地的野生群體的遺傳組成受到了影響,從而與南方種群結(jié)構(gòu)越來越接近, 親緣關(guān)系也越來越近; 也可能受沿岸流和暖流的影響, 使連云港以北和以南的基因交流受到了限制, 從而使南北群體產(chǎn)生了遺傳分化。

Liu等(2007)研究結(jié)果表明異地購苗增養(yǎng)殖對菲律賓蛤仔野生群體的遺傳結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定的影響,所以青島群體與廈門群體的遺傳相似度較高。但是本研究中大連群體和榮成群體具有較高的遺傳相似度,而其余8群體具有較高的遺傳相似度, 明顯形成兩大類群。雖然北方在養(yǎng)殖過程中很大一部分苗種引自南方, 但大連群體和榮成群體與南方種群未顯示出高的遺傳相似度, 說明大連和榮成的野生群體結(jié)構(gòu)未被影響, 而其余8群體的遺傳結(jié)構(gòu)在一定程度上受到了苗種異地放養(yǎng)的影響。Kim等(2015)應(yīng)用5個PNA探針很好地區(qū)別出了韓國當(dāng)?shù)胤坡少e蛤仔和引自大連的菲律賓蛤仔。因此在本研究基礎(chǔ)上, 如果能夠應(yīng)用 Kim 等(2015)的方法進一步對遺傳結(jié)構(gòu)受到苗種異地放養(yǎng)影響的群體進行研究, 確定這些群體受苗種異地放養(yǎng)影響的程度, 將為菲律賓蛤仔的種群結(jié)構(gòu)研究提供更為有力的數(shù)據(jù)支撐。

4 結(jié)論

我國沿海菲律賓蛤仔種群具有相對較高的遺傳多樣性, 并且以連云港為界分為南北兩大類群, 其中北方種群生物多樣性高于南方種群, 本研究為菲律賓蛤仔的養(yǎng)殖和生物資源保護提供了生物學(xué)參考依據(jù)。至2014年, 10m等深線以內(nèi)的淺海基本都被開發(fā)用于貝類的養(yǎng)殖, 而菲律賓蛤仔已成為淺海養(yǎng)殖第一大品種(車向慶等, 2015), 作為具有經(jīng)濟價值的物種, 為保證其生物多樣性, 防止種質(zhì)退化, 在養(yǎng)殖過程中要針對南北兩大類群特點進行合理有效的保護。

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