應(yīng)用多參數(shù)技術(shù)方法對腦缺血皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的檢測

張文麗朱瑩王瑞敏李倩郭靜劉國榮耿福

(河北聯(lián)合大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗研究中心， 唐山 063000)

摘要：隨著生物科學(xué)研究技術(shù)的不斷提高和對細(xì)胞凋亡認(rèn)識的不斷深入，在細(xì)胞凋亡確認(rèn)過程中，若單獨使用一種方法檢測會出現(xiàn)一定概率的假陽性，往往需要采用多參數(shù)技術(shù)方法相互印證。本實驗結(jié)合透射電鏡、流式細(xì)胞儀和共聚焦顯微鏡的檢測技術(shù)及原理，通過多技術(shù)相結(jié)合觀察判斷了急性腦缺血皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡,并進(jìn)行了定性、定量分析。

關(guān)鍵詞：腦缺血；皮質(zhì)細(xì)胞；凋亡檢測

作者簡介：張文麗，女，1974年出生，高級實驗師，研究方向：腦缺血及腦損傷機制，E-mail：dianj@163.com。

DOI:10.3936/j.issn.1001-232x.2015.01.014

收稿日期：2014-07-19

Detection of nerve cell apoptosis in ischemic cortex by multi-parameter technology.ZhangWenli，ZhuYing，WangRuimin，LiQian，GuoJing，LiuGuorong，GengFu(MedicalLaboratoryResearchCenter,HebeiUnitedUniversity,Tangshan063000,China)

Abstract:This article decided the acute ischemic cortex neurons apoptosis which combined the detection technology and principles of transmission electron microscope, flow cytometry and laser scanning confocal microscope. And conducted the qualitative and quantitative analysis.

Key words：cerbral ischemic; cortial cells; detection of apoptosis

1前言

腦缺血性疾病是人類常見病、多發(fā)病，有關(guān)研究較多。但迄今為止其機理仍未完全清楚。急性腦缺血在臨床上是最常見的腦卒中類型，占全部腦卒中的60%～80%。近年來大量研究表明[1-3]，急性腦缺血通過各種原因引起腦血液循環(huán)灌注不足，腦組織發(fā)生病理性的改變。神經(jīng)細(xì)胞的凋亡是腦缺血后神經(jīng)元死亡的重要方式。正常腦發(fā)育過程中有30～70%的神經(jīng)元是通過凋亡來清除老化細(xì)胞，細(xì)胞凋亡不僅在正常發(fā)育的神經(jīng)元中發(fā)生，也在許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)生并起重要作用，如腦梗塞、腦外傷、脊髓損傷等。因此研究神經(jīng)細(xì)胞的凋亡在神經(jīng)科學(xué)中已成為了一個非?；钴S的領(lǐng)域。細(xì)胞凋亡發(fā)生的原因和途徑是復(fù)雜多樣的，腦缺血損傷誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡途徑包括線粒體途徑，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)受體途徑，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑等[4-6]。

細(xì)胞凋亡是有核細(xì)胞在一定條件下啟動的其自身內(nèi)部機制, 主要通過內(nèi)源性 DNA內(nèi)切酶的激活而發(fā)生的自然死亡過程,受基因調(diào)控,需新的蛋白質(zhì)合成。細(xì)胞凋亡對細(xì)胞增殖、組織的發(fā)生和機體的功能維持起著重要作用。但在病理條件下，機體可誘發(fā)細(xì)胞凋亡發(fā)生。在形態(tài)學(xué)上凋亡截然不同于細(xì)胞壞死，凋亡可通過形態(tài)學(xué)觀察、DNA片斷化分析及凋亡相關(guān)分子蛋白檢測等確定。但對凋亡形態(tài)認(rèn)定結(jié)合細(xì)胞的定量分析也是檢測細(xì)胞凋亡最直接可靠的方法。

2材料和方法

2.1　模型建立與動物分組

SPF級雄性SD大鼠20只，體重280～350g，由北京市華阜康生物科技股份有限公司提供。在我校動物飼養(yǎng)中心標(biāo)準(zhǔn)化喂養(yǎng)。通過兩血管法即雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎建立腦缺血模型[7，8]；首先用10%水合氯醛(0.3mL/100g)腹腔注射麻醉，頸部消毒后正中切口，鈍性分離出雙側(cè)迷走神經(jīng)與頸總動脈，用4號絲線雙重結(jié)扎剪斷頸總動脈，縫合切口時注入慶大霉素4萬單位預(yù)防感染。大鼠隨機分為四組，對照組、腦缺血后6h、24h、72h組；對照組不致傷，本實驗符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

2.2　透射電鏡取材及樣品制備

各組大鼠麻醉后斷頭，均切取左側(cè)腦皮質(zhì)組織，1mm×1mm×2mm大小，放入2.5%戊二醛液中固定3h，再用1%鋨酸后固定1h，乙醇梯度脫水，環(huán)氧樹脂815包埋，超薄切片75nm ，醋酸鈾染色15min，檸檬酸鉛染色10min，日本Hitachi公司H-7650型透射電鏡觀察分析，美國Gatan公司CCD相機拍照。

2.3　流式細(xì)胞儀測定

將剩余左側(cè)腦皮質(zhì)組織切碎后置于4℃70%乙醇中保存。研磨腦組織，生理鹽水沖洗, 制備成組織懸液，將組織懸液收集后離心5min,棄上清,向沉淀物中加入0.5%胃蛋白酶2mL，37℃消化30min,加入生理鹽水稀釋到5mL再次過濾，將濾液離心3min，棄上清。向沉淀物中加入細(xì)胞核熒光素溴化乙啶(EB，10μg/mL)，染色30min, 美國BD公司Facscdidur流式細(xì)胞儀分析。每個樣品分析1×106/mL細(xì)胞,計算細(xì)胞凋亡率。

2.4　激光共聚焦顯微鏡樣品制備

取同一只大鼠的右側(cè)腦皮質(zhì)組織用10%福爾馬林固定，石蠟包埋切片，撈片于多聚賴氨酸防脫載玻片上，常規(guī)脫蠟、脫水，用蛋白酶K室溫孵育30min，PBS沖洗樣品，滴加50ulTUNEL反應(yīng)液進(jìn)行標(biāo)記，37℃濕盒內(nèi)孵育1h，PBS沖洗樣品,日本Olympus公司FV1000型共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

2.5　統(tǒng)計學(xué)處理

3結(jié)果

3.1　透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察

對照組大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞核膜清晰完整，核大而圓，核內(nèi)異染色質(zhì)及常染色質(zhì)分布正常，胞質(zhì)有大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及豐富的游離核糖體;線粒體結(jié)構(gòu)完整。軸索結(jié)構(gòu)正常。6h組神經(jīng)元細(xì)胞核不規(guī)則，核膜凹陷，核內(nèi)異染色質(zhì)及常染色質(zhì)分布基本正常，線粒體部分空化變性。24h組皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞皺縮，核內(nèi)染色質(zhì)分布不均勻，異染色質(zhì)邊集，細(xì)胞呈凋亡早期改變，胞漿內(nèi)線粒體腫脹、空化；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張、有脫顆粒現(xiàn)象，核糖體減少。軸索結(jié)構(gòu)排列紊亂、腫脹。48h組神經(jīng)元細(xì)胞核內(nèi)異染色質(zhì)邊集、核固縮，呈典型凋亡樣改變。細(xì)胞器少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，線粒體腫脹、空化。鏡下較6h、24h組有明顯核固縮及凋亡細(xì)胞征象，也多見死亡細(xì)胞。72h組神經(jīng)元細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)分布不均勻，異染色質(zhì)邊集，有部分線粒體腫脹、空化；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張；細(xì)胞呈凋亡樣改變(圖1)。

圖1　透射電鏡下超微結(jié)構(gòu)(1500x) A正常組，B 6h組, C 24h組, D 48h組, E72h組, 箭頭示神經(jīng)元細(xì)胞核

3.2　大鼠腦皮質(zhì)細(xì)胞凋亡發(fā)生率的影響

流式細(xì)胞術(shù)通過熒光染料與細(xì)胞的特異性結(jié)合,有一定的量效關(guān)系。在腦缺血6h、24h、48h、72h組與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；提示腦缺血后早期皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞凋亡率隨缺血時間的延長而增加，6h組細(xì)胞凋亡率較低，48h組細(xì)胞凋亡率最高，與24h、48h組相比，72h組細(xì)胞凋亡率有所降低(圖2)。

圖2　缺血后各時間點腦皮質(zhì)凋亡細(xì)胞率 注： #與對照組相比p<0.05

3.3　激光共聚焦顯微鏡腦皮質(zhì)掃描結(jié)果

激光共聚焦顯微鏡下一些細(xì)胞熒光顏色的改變與神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。本實驗中TUNEL(綠色熒光)陽性染色代表凋亡樣損傷的神經(jīng)元。對照組神經(jīng)元排列整齊緊密，凋亡的神經(jīng)元數(shù)量極少，6h組可見生存的神經(jīng)元數(shù)量較少，而凋亡樣損傷的神經(jīng)元數(shù)量增多(p<0.05)，24h、48h組可見大量凋亡樣神經(jīng)元，存活的神經(jīng)元數(shù)量明顯減少(p<0.05)，72h組仍可見大量凋亡樣損傷神經(jīng)元，但較24h、48h組有所減少(p<0.05)(圖3、圖4)。

圖3　激光共聚焦顯微鏡腦皮質(zhì)凋亡細(xì)胞

圖4　缺血后各時間點腦皮質(zhì)細(xì)胞凋亡數(shù)量

4討論

國內(nèi)外大量研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)腦梗死和老年癡呆癥的發(fā)病前期都曾有腦缺血的存在[9]。本實驗通過手術(shù)，進(jìn)行永久性結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動脈，制備急性腦缺血動物模型，這種方法實質(zhì)上是由于大腦特定部位的血流供應(yīng)受阻所導(dǎo)致的血氧不足或腦缺氧，不能滿足腦部能量的供給，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的功能下降。較好地模擬了臨床急性腦梗塞或缺血性中風(fēng)疾病。腦缺血后，神經(jīng)元損傷具有選擇性和易損性的特點。細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果直觀, 至今仍是判定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡的金標(biāo)準(zhǔn)。電鏡下一些細(xì)胞核染色質(zhì)的改變與神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。缺血6h組神經(jīng)元細(xì)胞核不規(guī)則，核膜凹陷，線粒體略有腫脹。24h及48h組凋亡形態(tài)細(xì)胞較多，細(xì)胞核內(nèi)染色體凝縮并沿核膜形成團(tuán)塊,細(xì)胞質(zhì)開始濃縮,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)解體,線粒體腫脹,但沒看見凋亡小體出現(xiàn)。72h組有細(xì)胞皺縮，細(xì)胞器有腫脹、空化、核染色質(zhì)不均勻等凋亡現(xiàn)象。

流式細(xì)胞儀和激光共聚焦顯微鏡對細(xì)胞的定量、細(xì)胞熒光定位分析是不可或缺的檢測技術(shù)，可以彌補電鏡形態(tài)檢測的局限性。流式細(xì)胞儀對檢測的細(xì)胞經(jīng)過熒光染色后，通過激光檢測區(qū)時受激光激發(fā)，發(fā)出特定波長的熒光通過濾色片，可將不同波長的散射光、熒光信號區(qū)分開來，并傳送到不同的光電倍增管中，經(jīng)過信號轉(zhuǎn)換、放大，數(shù)字化處理對細(xì)胞進(jìn)行定量及其分選的分析。激光共聚焦顯微鏡可進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)定位、定量熒光測定、定量圖像分析等實用研究[10]?？梢垣@得普通光鏡無法達(dá)到的分辨率。本研究的結(jié)果表明急性腦缺血造成大鼠皮層腦組織發(fā)生細(xì)胞凋亡,凋亡的細(xì)胞數(shù)量隨缺血時間的不同具有一定的時相性, 6h組可見少量凋亡的神經(jīng)細(xì)胞,24h繼續(xù)增加,48h凋亡的神經(jīng)細(xì)胞較多，達(dá)到高峰,72h有所減少。流式細(xì)胞儀檢測與激光共聚焦檢測結(jié)果相一致。主要可能由于腦缺血缺氧致使線粒體的氧化磷酸化作用受到影響，細(xì)胞合成或分泌蛋白質(zhì)的過程受阻，神經(jīng)遞質(zhì)、第二信使、酶類、受體減少，能量供應(yīng)不足，DNA的轉(zhuǎn)錄復(fù)制功能降低；導(dǎo)致神經(jīng)元代謝功能紊亂；呈現(xiàn)一種遲發(fā)性神經(jīng)元凋亡現(xiàn)象。

總之，細(xì)胞凋亡的檢測方法很多，都是基于細(xì)胞凋亡過程中的各種特征進(jìn)行設(shè)計的，不同的實驗條件，檢測得到細(xì)胞凋亡的結(jié)果也不一樣，到目前，每種檢測方法都有它一定的局限性。在進(jìn)行實驗時, 要采用并綜合多參數(shù)技術(shù)方法進(jìn)行檢測相互論證，才能捕捉到有利的、明顯的細(xì)胞凋亡證據(jù)。

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