用于激光共聚焦顯微鏡的光譜掃描機(jī)構(gòu)

朱磊1，2*張運(yùn)海1，2

(1.中國(guó)科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所 醫(yī)用光學(xué)室，蘇州 215163；2.江蘇省醫(yī)用光學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 蘇州 215163)

摘要：隨著生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，組織樣本經(jīng)常被多種熒光標(biāo)記物標(biāo)記，需要通過(guò)光譜成像的方法區(qū)分出樣本中不同的成分。本文在共聚焦顯微鏡基礎(chǔ)上，介紹了一種由精密絲杠和步進(jìn)電機(jī)控制的狹縫機(jī)構(gòu)實(shí)現(xiàn)光譜成像的方法，討論了狹縫縫片的具體設(shè)計(jì)和狹縫運(yùn)動(dòng)精度對(duì)光譜帶寬和波長(zhǎng)準(zhǔn)確度的影響。

關(guān)鍵詞：共聚焦顯微鏡；光譜成像；狹縫

作者簡(jiǎn)介：朱磊，男，1979出生，工程師，主要從事激光共聚焦顯微鏡成像技術(shù)方面的研究，E-mail：freewind2000@163.com。

DOI:10.3936/j.issn.1001-232x.2015.01.012

收稿日期：2014-06-06

A spectral scanning mechanism for laser scanning confocal microscopy.ZhuLei1,2*,ZhangYunhai1 2(1.SuzhouInstituteofBiomedicalEngineeringandTechnology,ChineseAcademyofSciences,Suzhou215163,China;2.JiangsuKeyLab.ofMedicalOptics,Suzhou215163,China)

Abstract:This paper introduces a slit mechanism controlled by two precision lead screw and stepper motor, and discusses the accuracy of the spectral bandwidth which is affected by the slit kinematics.

Key words：laser scanning confocal microscopy;spectral imaging;slit

1概述

激光掃描共焦顯微鏡[1,2](Laser Scanning Confocal Microscopy，LSCM)是研究亞微米細(xì)微結(jié)構(gòu)的有效技術(shù)手段。不同于一般的熒光顯微成像，共焦顯微鏡在光路中加入與物點(diǎn)共軛的探測(cè)針孔，起到空間濾波作用，能夠去除離焦熒光的干擾，獲得高信噪比的圖像；共聚焦顯微鏡通過(guò)逐點(diǎn)逐層的掃描方式，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)觀測(cè)樣品區(qū)域的三維成像。激光掃描共焦顯微鏡在組織生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、基因?qū)W、胚胎學(xué)、神經(jīng)學(xué)、病理學(xué)、免疫學(xué)、流行病學(xué)、腫瘤學(xué)、細(xì)菌學(xué)、病毒學(xué)等生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用。

使用熒光光譜儀對(duì)多熒光標(biāo)記樣品產(chǎn)生的熒光，進(jìn)行光譜分光并探測(cè)，需要滿足較高的熒光光譜分辨率。由于共聚焦中熒光信號(hào)自身就很低，經(jīng)過(guò)光譜分光后的信號(hào)則變得更為弱小，因此光譜儀的效率尤為重要。

共聚焦激光顯微鏡中完成光譜成像首先要對(duì)探測(cè)的熒光進(jìn)行光譜分光，光譜分光主要基于兩種方式，分別是棱鏡分光和光柵分光。在光柵分光中因?yàn)閷?duì)分光元件的旋轉(zhuǎn)精度要求高，機(jī)構(gòu)大都結(jié)構(gòu)復(fù)雜，成本較高，不予采用。本文討論的光譜掃描技術(shù)是基于棱鏡分光基礎(chǔ)上，通過(guò)控制可移動(dòng)狹縫的直線運(yùn)動(dòng)設(shè)定狹縫寬度及中心位置[3]，移動(dòng)狹縫實(shí)現(xiàn)光譜掃描，完全滿足共聚焦的光譜帶寬和波長(zhǎng)精度要求[4]，結(jié)構(gòu)精簡(jiǎn)實(shí)用，成本較低，同時(shí)也能滿足在共聚焦顯微鏡中光譜掃描成像功能的要求。

2激光掃描共聚焦顯微鏡光譜成像系統(tǒng)的構(gòu)成

激光掃描共聚焦顯微鏡光譜成像系統(tǒng)示意圖如圖1所示，由分光模塊、狹縫掃描機(jī)構(gòu)、熒光探測(cè)模塊構(gòu)成。

共聚焦成像部分采用經(jīng)典的技術(shù)方案[5]，本文不予詳述。下面簡(jiǎn)單介紹在共聚焦顯微鏡技術(shù)基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)光譜成像技術(shù)方法，激光光源發(fā)出的準(zhǔn)直激光經(jīng)共聚焦光路后在組織樣本處聚焦，組織樣本中的熒光物質(zhì)被激光激發(fā)后沿相同的光路返回。返回的熒光通過(guò)針孔透鏡聚焦針孔，如圖1所示，再?gòu)尼樋壮錾浜蠼?jīng)準(zhǔn)直透鏡進(jìn)入分光棱鏡，分光棱鏡將熒光光譜展開(kāi)后再經(jīng)聚焦透鏡聚焦，形成一條光譜帶，在光譜帶位置處設(shè)置有兩個(gè)可以獨(dú)立移動(dòng)的縫片，兩個(gè)縫片之間形成一個(gè)出射狹縫，狹縫的寬度和狹縫相對(duì)于光譜帶的位置可以根據(jù)需要進(jìn)行設(shè)置，透過(guò)狹縫后的熒光成分進(jìn)入到PMT(光電倍增管)，PMT將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電流信號(hào)，對(duì)其進(jìn)行電信號(hào)采樣同時(shí)記錄下掃描單元的位置坐標(biāo)，進(jìn)行圖像重建就可以生成一幅二維共聚焦圖像[6]。

根據(jù)設(shè)計(jì)需求，本系統(tǒng)技術(shù)指標(biāo)如下：工作波長(zhǎng)范圍為400～700nm。最小光譜帶寬為5nm。

圖1　光譜成像系統(tǒng)示意圖

3光譜分光方案

光譜分光常采用棱鏡分光或光柵分光，光柵分光方法光能利用率低，而共聚焦顯微成像中，熒光較弱，此外經(jīng)過(guò)光譜分光后，由于熒光被光譜展寬，成像時(shí)只取光譜條帶中的一部分熒光能量進(jìn)行成像，有效使用的熒光很微弱，基于此，本研究擬采用光能利用率相對(duì)較高的棱鏡分光方案。

對(duì)于基于棱鏡的分光方式，是利用棱鏡材料對(duì)不同波長(zhǎng)的光有不同的折射率這一性質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。由折射定律和幾何關(guān)系可知，當(dāng)棱鏡工作在最小偏向角情況時(shí)，棱鏡的角色散為

(1)

A為棱鏡頂角，dn/dλ為棱鏡的物質(zhì)色散，n為棱鏡材料的折射率。材料的折射率與波長(zhǎng)的關(guān)系可由Cauchy公式、Schott公式、Sellmeier公式等得到。

(2)

由于不同波長(zhǎng)出射光線的偏向角dδ是非線性，這就導(dǎo)致不同波長(zhǎng)出射光線在光譜像面上對(duì)中心波長(zhǎng) λ的位移也是非線性的，表1給出了不同波長(zhǎng)時(shí)光譜儀的線色散數(shù)及狹縫掃描位移距離的數(shù)據(jù)。

表1　不同波長(zhǎng)狹縫移動(dòng)量

對(duì)棱鏡來(lái)說(shuō)，很重要的一個(gè)特點(diǎn)是僅具有一個(gè)光譜條帶，這就使得它不存在光譜級(jí)次之間的重疊，其自由光譜范圍也不受限制，并且入射光能量得到充分的利用，光能透過(guò)效率整體較高，探測(cè)的靈敏度高。但是它的色散是非線性的。

分光棱鏡的可選材料多種多樣，應(yīng)當(dāng)按照儀器實(shí)際要求進(jìn)行篩選。本系統(tǒng)初始條件要求譜面不大于6mm，則整個(gè)光譜范圍的平均線色散倒數(shù)dλ/dl不大于50nm/mm，狹縫最小寬度50μm對(duì)應(yīng)的極限分辨率為5nm，則要求任意波長(zhǎng)下的線色散倒數(shù)dλ/dl不大于125nm/mm。

ZF4的線色散倒數(shù)為7.7～72.4nm/mm，F(xiàn)4線色散倒數(shù)為16.4～118.6nm/mm，(如圖2所示)符合初始條件對(duì)線色散倒數(shù)的要求，其余材料在部分波段線色散倒數(shù)大于125nm/mm，分辨極限達(dá)不到要求，重火石玻璃色散能力強(qiáng)，但在藍(lán)、紫波段吸收強(qiáng)，透過(guò)率很低，相比而言，火石玻璃更適合。在400～700nm范圍內(nèi)，譜面上的線色散倒數(shù)為整個(gè)譜面長(zhǎng)度為6.87mm，超過(guò)初始條件要求，篩選火石玻璃中其余牌號(hào)并計(jì)算各材料對(duì)應(yīng)的譜面大小，結(jié)果如表2。

表2　各牌號(hào)火石玻璃對(duì)應(yīng)的譜面長(zhǎng)度

圖2　相同布局下多種材料線色散倒數(shù)

可以看出，所有材料的色散譜面均超過(guò)要求。受探測(cè)器件本身外形尺寸的限制，當(dāng)探測(cè)器直接接收經(jīng)過(guò)狹縫后的熒光信號(hào)，只有在譜面非常狹窄時(shí)，感光面才可覆蓋最大譜面(400～700nm范圍)，此時(shí)，極限分辨率已大大超過(guò)5nm，且對(duì)機(jī)構(gòu)的運(yùn)動(dòng)精度要求提高。本系統(tǒng)在現(xiàn)有情況下，加裝了焦距100mm的聚焦鏡(圖1)實(shí)現(xiàn)收集整個(gè)譜面信號(hào)的效果，因此對(duì)譜面大小的要求可根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)放寬，現(xiàn)有幾種火石玻璃均可滿足要求。

下面以F4為例，分析棱鏡的非線性色散在不同波段對(duì)于光譜參數(shù)和狹縫位移精度的要求。表3為不同波長(zhǎng)下波長(zhǎng)間隔50nm對(duì)應(yīng)的譜面大小，不同波長(zhǎng)處狹縫移動(dòng)的要求見(jiàn)表4。

表3　不同波段50nm譜寬對(duì)應(yīng)的實(shí)際譜面長(zhǎng)度

表4　不同起始波長(zhǎng)下模塊的光譜性能與對(duì)狹縫移動(dòng)量的要求

續(xù)表4

由表4可見(jiàn)，本模塊的極限分辨率達(dá)到要求，當(dāng)帶寬改變3nm時(shí)對(duì)應(yīng)的最小狹縫位移量為25.4μm，因此且當(dāng)狹縫機(jī)構(gòu)運(yùn)動(dòng)精度達(dá)到在10μm 時(shí)，對(duì)應(yīng)的光譜帶寬的選擇精度達(dá)到了1nm。

4狹縫機(jī)構(gòu)設(shè)計(jì)

4.1　整體機(jī)構(gòu)

在狹縫的技術(shù)指標(biāo)方面，確定出射狹縫寬度最小50μm，調(diào)節(jié)范圍0.05～6.7mm，縫片調(diào)節(jié)增量10μm。根據(jù)以上需求，設(shè)計(jì)出如圖3所示的狹縫結(jié)構(gòu)：狹縫固定座兩端分別固定步進(jìn)電機(jī)，電機(jī)帶動(dòng)狹縫滑塊運(yùn)動(dòng)，左右狹縫固定在兩個(gè)狹縫運(yùn)動(dòng)滑塊上，狹縫運(yùn)動(dòng)座兩端裝有位置傳感器標(biāo)定狹縫初始位置，中間防碰撞傳感器防止狹縫運(yùn)動(dòng)時(shí)發(fā)生碰撞。工作時(shí)，狹縫初始化，左右狹縫分別觸發(fā)兩側(cè)的位置傳感器，狹縫縫片復(fù)零位?？刂葡到y(tǒng)根據(jù)設(shè)計(jì)確定的特定譜帶或波段488nm的位置，驅(qū)動(dòng)兩側(cè)電機(jī)運(yùn)動(dòng)，將左右狹縫精確運(yùn)動(dòng)至所需的對(duì)應(yīng)距離。

圖3　移動(dòng)式狹縫機(jī)構(gòu) 1.左縫片驅(qū)動(dòng)電機(jī) 2.狹縫固定座 3.左絲杠運(yùn)動(dòng)副 4.右絲杠運(yùn)動(dòng)副 5.右縫片驅(qū)動(dòng)電機(jī) 6.右光耦 7.防碰撞光耦 8.右縫片 9.左縫片 10.左光耦

直線運(yùn)動(dòng)副的結(jié)構(gòu)合理是實(shí)現(xiàn)左右縫片直線精確控制的前提條件，如未加彈簧消隙時(shí)，機(jī)構(gòu)運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生較大的震顫，無(wú)法達(dá)到設(shè)計(jì)要求的最小縫寬及重復(fù)定位精度需求，調(diào)整為圖4所示的彈簧阻尼消隙結(jié)構(gòu)后，證明縫片運(yùn)動(dòng)可以滿足需求。

圖4　螺紋運(yùn)動(dòng)副消隙彈簧結(jié)構(gòu)

4.2　狹縫縫片設(shè)計(jì)

縫片作為移動(dòng)式狹縫的核心零件，其設(shè)計(jì)加工及裝校都有特殊要求。如圖5所示，在設(shè)計(jì)處理上，縫邊留有0.03mm的倒角，用以避免破壞刃口。刃口寬度設(shè)計(jì)為0.1mm，直線度0.002mm，各表面粗糙度達(dá)到P及P1。在材料選擇上要選用不銹鋼金屬材料，熱處理后進(jìn)行表面研磨，其研磨效果直接關(guān)系到相關(guān)刃面的反射效果。除刃口端面外的其余表面鍍黑鉻處理，避免反射雜散光?？p片成對(duì)檢測(cè)，縫寬為0.002左右時(shí)在30X顯微鏡下觀察，縫紉清晰，間隙均勻，閉合時(shí)狹縫全長(zhǎng)同時(shí)完全閉合，縫刃平直且合攏后無(wú)漏光。

圖5　縫片刃口形狀及公差要求

4.3　位置傳感器及消空回設(shè)計(jì)

位置傳感器使用歐姆龍EE-SX770A，定位精度2μm(圖6)。

圖6　光耦及狹縫觸發(fā)示意圖

如圖6所示，左側(cè)縫片從左觸發(fā)點(diǎn)向中間觸發(fā)點(diǎn)移動(dòng)到剛好觸發(fā)停止，從左縫片觸發(fā)點(diǎn)開(kāi)始計(jì)步，防碰傳感器剛好觸發(fā)的瞬間停止計(jì)步，重復(fù)100次，實(shí)驗(yàn)記錄最大值為3075，最小值為3072，單側(cè)縫片步進(jìn)2.5μm，對(duì)應(yīng)差值7.5μm。證明縫片重復(fù)定位精度在10μm之內(nèi)。對(duì)應(yīng)的光譜帶寬選擇精度能夠達(dá)到1nm。

需要注意的是絲桿傳動(dòng)副機(jī)構(gòu)在運(yùn)動(dòng)中總是會(huì)有空回產(chǎn)生，雖然機(jī)構(gòu)中增加了消隙彈簧，但并不能完全消除。因此在光耦傳感器的使用上往往在達(dá)到觸發(fā)點(diǎn)時(shí)，使運(yùn)動(dòng)機(jī)構(gòu)多走一點(diǎn)，再反向運(yùn)動(dòng)重新觸發(fā)光耦，這樣單項(xiàng)運(yùn)動(dòng)可以充分消除運(yùn)動(dòng)機(jī)構(gòu)自身的回程誤差給系統(tǒng)帶來(lái)的影響，也是精密運(yùn)動(dòng)時(shí)對(duì)光耦觸發(fā)常采用的方法。

4.4　狹縫機(jī)構(gòu)的安裝固定

圖7為狹縫的安裝結(jié)構(gòu)圖，狹縫機(jī)構(gòu)垂直安裝在固定圓盤上，光路在固定圓盤上為分光結(jié)構(gòu)，光路平行于水平基準(zhǔn)面，狹縫設(shè)計(jì)安裝時(shí)，要求縫片與平面平行度誤差不大于0.05mm，因此需要在安裝狹縫的同時(shí)對(duì)狹縫機(jī)構(gòu)水平度進(jìn)行調(diào)校。這對(duì)可視化調(diào)校方面提出了較高就要求，本系統(tǒng)通過(guò)結(jié)合CCD(圖像傳感器)觀察狹縫縫片解決了這個(gè)問(wèn)題。

圖7　狹縫機(jī)構(gòu)安裝示意圖

5狹縫機(jī)構(gòu)精度標(biāo)定

縫片定位精度影響光譜帶寬的選擇精度，本系統(tǒng)縫片重復(fù)定位精度10μm。而縫片定位精度由提供定位基準(zhǔn)的位置傳感器的定位精度、步進(jìn)電機(jī)的運(yùn)動(dòng)精度以及狹縫絲杠傳動(dòng)副的運(yùn)動(dòng)精度共同決定。位置傳感器定位精度2μm。電機(jī)為混合式步進(jìn)電機(jī)，步長(zhǎng)0.0025mm，該直線步進(jìn)電機(jī)還可以進(jìn)行微步進(jìn)驅(qū)動(dòng)以獲得精密的分辨率，并使電機(jī)運(yùn)動(dòng)時(shí)更為平滑，消除微弱顫動(dòng)對(duì)狹縫精密運(yùn)動(dòng)帶來(lái)的影響。為精確標(biāo)定縫片移動(dòng)位置和波長(zhǎng)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，用CCD將縫片所在的光譜面成像記錄下來(lái)，組成1∶1成像系統(tǒng)， CCD像元尺寸為4.4×4.4μm。

采用低壓汞燈和特定波長(zhǎng)激光測(cè)量標(biāo)定狹縫位置和波長(zhǎng)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，用波段405nm、488nm、638nm的激光和低壓汞燈照明狹縫，用CCD探測(cè)結(jié)果。低壓汞燈含有5種波長(zhǎng)的光：404.7nm、435.8 nm、546.1nm、577.0nm、579.1nm。將上下縫片分別移動(dòng)到兩側(cè)光耦起始觸發(fā)點(diǎn)處，狹縫此時(shí)張開(kāi)到最大值。固定左縫片后，移動(dòng)右縫片至405nm、436nm、488nm、546nm、578nm、638nm對(duì)應(yīng)的位置，重復(fù)操作，CCD探測(cè)的結(jié)果如圖8所示。

圖8　低壓汞燈及405nm、488nm、638nm激光譜線測(cè)試圖

檢測(cè)狹縫機(jī)構(gòu)定位精度測(cè)試。狹縫縫片依靠步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)，讓電機(jī)多次運(yùn)動(dòng)，每次運(yùn)動(dòng)相同步數(shù)，觀察停止位置的差異，驗(yàn)證狹縫組件總的定位精度。具體實(shí)現(xiàn)時(shí)，以光耦為運(yùn)動(dòng)起點(diǎn)，擋片離開(kāi)光耦時(shí)開(kāi)始計(jì)數(shù)，運(yùn)動(dòng)700步，重復(fù)多次，停止位置偏差2~3像素，說(shuō)明狹縫組件重復(fù)性為10μm左右。

測(cè)試結(jié)果證明，移動(dòng)式狹縫機(jī)構(gòu)不論是狹縫運(yùn)行速度，還是狹縫重復(fù)定位精度都能夠較好滿足整體設(shè)計(jì)參數(shù)需求。

6結(jié)論

通過(guò)實(shí)際應(yīng)用效果研判，本狹縫機(jī)構(gòu)能夠完成整體設(shè)計(jì)指標(biāo)要求。即譜帶范圍涵蓋波長(zhǎng)400~700nm，出射狹縫寬度最小達(dá)到了50μm，對(duì)應(yīng)5nm光譜帶寬，調(diào)節(jié)范圍在0.05～6.7mm。該狹縫結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)合理，調(diào)節(jié)方便，響應(yīng)時(shí)間快，結(jié)構(gòu)精巧實(shí)用，滿足了激光共聚焦顯微鏡光譜掃描的需求。

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