紅豆越橘離體培養(yǎng)關(guān)鍵技術(shù)研究

田新華，邢亞娟，張建瑛，郭樹平*

(黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所，哈爾濱，150081)

摘要：以紅豆越橘優(yōu)樹為材料，研究影響紅豆越橘離體培養(yǎng)的因素，篩選適合的外植體滅菌方法及培養(yǎng)基配方，攻克試管苗生根難題，建立完整的組織培養(yǎng)體系。試驗(yàn)結(jié)果表明：以WPM(改良)+6-BA1.0mg/L+ZT0.5mg/L培養(yǎng)基培養(yǎng)30 d的試管苗增殖倍數(shù)達(dá)3.8；以苔蘚培養(yǎng)的試管苗瓶外生根效果較好，平均生根3.8條，平均根長(zhǎng)1.32 cm；并且試管苗在9月份移栽較易成活。

關(guān)鍵詞：紅豆越橘；組織培養(yǎng)；瓶外生根

中圖分類號(hào)：S 663.9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-005X(2015)02-0057-04

Abstract：The impact factors for the in vitro culture of Vaccinnium vitis-idaea L.were studied，and the propoer sterilization method of explants and culture medium were selected，and a complete tissue culture system was established.The results showed that the medium formula was WPM+6-BA1.0 mg/L+ZT0.5 mg/L(improved)，the proliferation was 3.8 times for 30 d；ex vitro rooting effect was good in moss cultured plantlets with average number of roots of 3.8 and average root length of 1.32 cm；and the plantlets transplanting was easy to survive in September.

Keywords：Vaccinnium vitis-idaea L.；tissue culture；rooting outside test tube

收稿日期：2014-11-05

基金項(xiàng)目：森工總局科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(sgzjT2013005)；省林業(yè)廳資助項(xiàng)目(201004068-6)

作者簡(jiǎn)介：第一田新華，碩士，副研究員。研究方向：森林培育、遺傳育種。

通訊作者：*郭樹平，碩士，研究員。研究方向：森林培育。

Study on Key Techniques of In VitroCulture fromVaccinniumvitis-idaeaL.

Tian Xinhua，Xing Yajuan，Zhang Jianying，Guo Shuping*

(Heilongjiang Forest Research Institute，Harbin 150081)

E-mal：hljgsp@163.com

引文格式：田新華，邢亞娟，張建瑛，等.紅豆越橘離體培養(yǎng)關(guān)鍵技術(shù)研究[J].森林工程，2015，31(2)：57-60.

紅豆越橘(Vacciniumuitis-idaea)，又名紅豆、牙疙瘩[1]，屬杜鵑花科越橘屬植物。紅豆越橘作為一種新興的第三代保健水果，已被國(guó)際糧農(nóng)組織列為人類五大保健食品之一[2-4]。

但是近年來由于人類對(duì)森林漿果植物資源進(jìn)行無(wú)計(jì)劃掠奪式的采摘，致使野生資源遭到嚴(yán)重破壞，自然修復(fù)能力降低，蘊(yùn)藏量和可采量銳減，野生資源瀕危枯竭，供需矛盾日趨加劇，價(jià)格猛漲，產(chǎn)地出現(xiàn)瘋狂采摘，造成了野生資源瀕臨滅絕的邊緣[5-6]。本試驗(yàn)擬采用組培技術(shù)對(duì)大興安嶺北部林區(qū)的紅豆越橘優(yōu)樹展開研究，旨在建立紅豆越橘的組培微繁技術(shù)，攻克生根難題，建立紅豆越橘組織培養(yǎng)體系，為今后優(yōu)良種質(zhì)資源的繁育，規(guī)范化、規(guī)模化大生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)；為種質(zhì)創(chuàng)新及種質(zhì)資源保存構(gòu)建技術(shù)平臺(tái)。

1試驗(yàn)材料與方法

1.1　試驗(yàn)材料與預(yù)處理

以我國(guó)大興安嶺北部林區(qū)的紅豆越橘優(yōu)良單株(YJ-1)的休眠健壯枝條為供試材料。用清水浸泡催芽，每天換水一次，水溫控制在18～20℃，大約5 d左右休眠腋芽開始萌動(dòng)。

1.2　外植體消毒滅菌處理

待腋芽萌發(fā)后，剪取長(zhǎng)約1.0 cm左右的單芽莖段，用流水反復(fù)清洗。在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行滅菌處理：

(1)75%酒精浸泡30 s，0.1%HgCI2浸泡2 min，然后用無(wú)菌水沖洗3次。

(2)75%酒精浸泡30 s，0.1% HgCI2浸泡3 min，用無(wú)菌水沖洗3次。

(3)0.1% HgCI2浸泡3 min，之后無(wú)菌水沖洗3次。

(4)0.1% HgCI2浸泡4 min，用無(wú)菌水沖洗3次。

以上材料滅菌后取出，用無(wú)菌濾紙吸干材料表面多余水分。每組處理10個(gè)莖段，2次重復(fù)，7 d后觀察效果。

2試驗(yàn)方法

2.1　誘導(dǎo)側(cè)芽生長(zhǎng)

以改良的WPM培養(yǎng)基(用Ca(NO3)2·4H2O，KNO3代替原WPM培養(yǎng)基中的CaCl2、K2SO4)為基本培養(yǎng)基，利用超凈工作臺(tái)的無(wú)菌環(huán)境，將帶有一個(gè)芽的莖段接種于WPM(改良)+ZT0.5 mg/L+20 g/L蔗糖+瓊脂粉6 g/L培養(yǎng)基上(PH值調(diào)到5.8)，誘導(dǎo)芽苗生長(zhǎng)，因素水平見表1。

2.2　試管苗增殖培養(yǎng)

待莖段腋芽伸長(zhǎng)后，轉(zhuǎn)接于以WPM(改良)為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度6-BA(0、0.5、1.0 mg/L)、ZT(0.5、1.0、2.0 mg/L)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，篩選適宜紅豆越橘試管苗分化增殖的培養(yǎng)基配方。采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表進(jìn)行芽苗增殖培養(yǎng)基篩選。每個(gè)處理接種10瓶，重復(fù)二次，無(wú)菌條件下培養(yǎng)30 d后調(diào)查苗木的苗高、分化數(shù)。

培養(yǎng)基中添加蔗糖20 g/L，日產(chǎn)瓊脂粉6 g/L，pH值調(diào)至5.8，溫度控制在22～25℃，光照強(qiáng)度2 000 Lux，光照時(shí)長(zhǎng)12 h/d。

表1　因素水平表 Tab.1 Factors and levels

2.3　試管苗瓶外生根培養(yǎng)

2.3.1不同基質(zhì)對(duì)紅豆越橘苗瓶外生根的影響

將供試的基質(zhì)用飽和KMnO4溶液消毒，滅菌30 min后大量清水沖洗，然后用塑料薄膜覆蓋陽(yáng)光暴曬24 h以上，通風(fēng)備用。供試基質(zhì)如下：

Ⅰ草炭+稻殼=1∶1Ⅱ苔蘚Ⅲ草炭Ⅳ草炭：蛭石=1∶1

將經(jīng)過分化培養(yǎng)的芽苗斜插于四種基質(zhì)中，每個(gè)處理扦插20株，重復(fù)3次，30 d后統(tǒng)計(jì)不同基質(zhì)中紅豆越橘試管苗生根率，篩選出適宜紅豆越橘生根的移栽基質(zhì)。

2.3.2不同移栽時(shí)間對(duì)紅豆越橘試管苗瓶外生根的影響

選用第Ⅱ號(hào)基質(zhì)為栽培基質(zhì)，將組培苗分別蘸取ABT 500、1 000 ppm，速蘸30 s，分別在5月、7月、9月進(jìn)行移栽試驗(yàn)研究，30 d后統(tǒng)計(jì)生根率，分析最適宜紅豆越橘試管苗移栽的時(shí)間。

2.4　統(tǒng)計(jì)分析方法

本試驗(yàn)采用Microsoft Excel 2003的統(tǒng)計(jì)工具進(jìn)行計(jì)算并作圖，dps7.05統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較[7]。

3結(jié)果與分析

3.1　不同滅菌方法的滅菌效果

獲取初始材料的一個(gè)重要制約因素就是初代培養(yǎng)的高污染率，所以選用適宜的滅菌方法至關(guān)重要。由表2可以看出，處理1滅菌不充分，污染率較高35%；處理4滅菌過度，盡管沒有污染，但苗木已經(jīng)大量褐化，嚴(yán)重影響外植體的生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致外植體死亡；處理3即用0.1%升汞浸泡3 min的滅菌方法，污染率為10 %，褐化率15%，其余外植體表現(xiàn)正常，是較適宜的滅菌方法。

表2　不同滅菌時(shí)間的滅菌效果 Tab.2 The sterilization effect under different sterilization time

3.2　誘導(dǎo)側(cè)芽生長(zhǎng)

觀察結(jié)果表明，越橘腋芽在改良后WPM+ZT0.5 mg/L培養(yǎng)基上培養(yǎng)8 d左右開始萌動(dòng)，經(jīng)培養(yǎng)12 d后節(jié)間伸長(zhǎng)、葉片展開，培養(yǎng)30 d后繁殖系數(shù)較高(平均新生芽苗數(shù)3.1個(gè))，葉片較多(平均葉片數(shù)12.0枚)，芽苗生長(zhǎng)速度較快(平均新生芽苗高1.12 cm)。

3.3　試管苗增殖培養(yǎng)基的篩選

將經(jīng)初代培養(yǎng)的試管苗切成1.0 cm左右的莖段轉(zhuǎn)接入不同激素組合的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通過觀察各處理培養(yǎng)30 d后的試管苗可知，因激素的種類、濃度的不同，不定芽的生長(zhǎng)狀況表現(xiàn)出明顯的不同。紅豆越橘莖段或莖尖的離體增殖率受到培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素的調(diào)控，伸長(zhǎng)生長(zhǎng)除受細(xì)胞分裂素調(diào)控外，還受生長(zhǎng)素的調(diào)控。從表3中可以看出不同性狀的極差分析結(jié)果，極差大的因素對(duì)性狀的影響較大。結(jié)果顯示，玉米素對(duì)紅豆越橘試管苗的苗高、分化都起著重要的作用。添加6-BA時(shí)，外植體也增殖，但增殖效果遠(yuǎn)不如ZT。經(jīng)方差分析(見表4)表明，無(wú)論對(duì)于控制紅豆越橘試管苗的苗高還是分化增殖數(shù)，A、B兩因素不同水平間差異均極顯著(p<0.01)。按F值分析，F(xiàn)值大的因素對(duì)結(jié)果影響較大，結(jié)果與上述分析一致。經(jīng)過對(duì)苗木生長(zhǎng)情況的SSR多重比較表明(見表5)，處理7培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的試管苗縱向生長(zhǎng)最快，分化增殖倍數(shù)最多。因此，選擇培養(yǎng)基(即處理7)WPM(改良)+6-BA1.0 mg/L+ZT0.5 mg/L為紅豆越橘的分化增殖培養(yǎng)基，分化芽苗數(shù)較多，苗木高度適中。

表3　不同激素對(duì)植株上部各性狀極差的影響 Tab.3 Effects of different hormones on the trait range of the upper part of the plant

表4　不同處理對(duì)紅豆越橘試管苗各性狀的方差分析 Tab.4 The variance analysis of different treatments on plantlets of Vaccinium Vitis idaea

注：p<0.05為差異顯著，p<0.01為差異極顯著。

3.4　紅豆越橘試管苗生根試驗(yàn)

3.4.1不同基質(zhì)對(duì)紅豆越橘存活的影響

將經(jīng)過分化增殖培養(yǎng)的試管苗成叢取出，用清水洗凈基部培養(yǎng)基。試管苗基部速蘸0.5%KMnO4消毒，然后浸蘸生根激素ABT 30S，栽到經(jīng)KMO4消過毒的基質(zhì)中誘導(dǎo)生根。利用霧化器加濕，相對(duì)濕度控制在80%～90%。

表5　不同處理植株上部性狀多重比較 Tab.5 Multiple comparisons of different processing plant shoots traits

注：要求芽苗高度≥0.3 cm

苗木移栽8 d左右出現(xiàn)不同程度的落葉現(xiàn)象，約在移栽的12 d苗木從靠近基質(zhì)的部位開始返青，移栽后的25 d部分苗木有新腋芽萌出。就在萌出的新芽基部產(chǎn)生根或是沒有新芽萌出的植株基部產(chǎn)生根。萎蔫的苗木則全株枯萎、埋入基質(zhì)部分已經(jīng)腐爛，見表6。試驗(yàn)結(jié)果表明：以基質(zhì)Ⅱ號(hào)誘導(dǎo)效果最好，并且都以1 000 ppm處理效果好，生根率分別為62.7%。平均生根3.8條，平均根長(zhǎng)1.32 cm。紅豆越橘的根系較細(xì)弱，根色偏紅，其上有多條纖細(xì)分支。

表6　不同基質(zhì)中苗木生根情況 Tab.6 The seedling rooting status in different matrixs

3.4.2不同移栽時(shí)間對(duì)紅豆越橘試管苗生根率的影響

將未切除愈傷組織的組培苗進(jìn)行移栽，結(jié)果表明，不同月份移栽的紅豆越橘試管苗存活率差異較大，見表7。5月份時(shí)陽(yáng)光溫室中午溫度可達(dá)30℃，紅豆越橘組培苗生根率特別低；7月份氣溫達(dá)到一年中最高值，紅豆越橘組培苗移栽生根率為零；9月份氣溫開始下降，白天氣溫在20～26℃，但夜間溫度為8～12℃，氣溫轉(zhuǎn)涼后比較適于紅豆越橘這種喜陰涼植物的生長(zhǎng)，生根率也大幅提升。

表7　不同移栽時(shí)間紅豆越橘的生根率的影響 Tab.7 Effect of different transplanting time on rooting rate forVaccinium Vitis idaea

將生根苗木連同基部基質(zhì)一同移栽入細(xì)砂：草炭：蛭石為1∶3∶2的 松軟基質(zhì)中(經(jīng)飽和KMO4消毒30 min后大量清水沖洗，然后用塑料薄膜覆蓋陽(yáng)光曝曬24 h以上)越冬培養(yǎng)，溫度控制在20～25℃，每天噴水一次。次年平均苗高可達(dá)8～10 cm，產(chǎn)生10～13個(gè)芽苗。

4結(jié)論

越橘外植體采用0.1%升汞浸泡3 min表現(xiàn)正常，污染率、褐化率均較低，是較適宜的滅菌方法。通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選WPM(改良)+6-BA1.0 mg/L+ZT0.5 mg/L為越橘試管苗分化增殖培養(yǎng)基，平均增殖倍數(shù)達(dá)3.8；9月份用消過毒的苔蘚為基質(zhì)誘導(dǎo)試管苗瓶外生根，平均生根率達(dá)62.7%，生根3.8條，根長(zhǎng)1.32 cm。

5討論

(1)植物離體快繁培養(yǎng)根的發(fā)生都來自不定根。一般木本植物比草本植物生根難，喬木比灌木難，成年樹比幼年樹難[8]。本研究針對(duì)越橘屬這類在試管中難以生根或根系發(fā)育不良，吸收功能極弱，移栽后不易成活的特點(diǎn)，本試驗(yàn)把生根和馴化相結(jié)合，采用了試管苗瓶外生根技術(shù)，有效地縮短了育苗周期，降低生產(chǎn)成本，節(jié)省空間，同時(shí)為了縮短育苗周期[9]，杜絕因煉苗移栽造成已生根苗木部分死亡的現(xiàn)象，提高了苗木的存活率。

(2)瓶外誘導(dǎo)生根必須嚴(yán)格管理，控制好溫濕度。試管苗由高濕、弱光的異養(yǎng)方式轉(zhuǎn)換為低濕、變溫的有菌環(huán)境，極易死亡[10]。因此瓶外生根應(yīng)采取覆膜或噴霧等方法保證空氣相對(duì)濕度為80-90%，并逐漸增加光照，保證苗基部的正常呼吸，防止失水萎蔫。

(3)正常植物組織培養(yǎng)過程中，植物的莖段采取正插培養(yǎng)方式。但是因植物莖段不定根形成的過程中需要氧氣，本研究中生根試驗(yàn)改正插為斜插培養(yǎng)，苗木生根量相對(duì)多而發(fā)達(dá)，有利于提高移栽成活率。經(jīng)苔蘚培養(yǎng)已經(jīng)生根的試管苗如圖1所示。

圖1　經(jīng)苔蘚培養(yǎng)已經(jīng)生根的試管苗 Fig.1 The moss cultured rooted plantlets

【參考文獻(xiàn)】

[1]祖榮.漿果學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1996.

[2]方瑞征.中國(guó)越橘屬的研究[J].云南植物研究，1986，3(8)：239-258.

[3]王慶菊，周泳，李海，等.紅豆越橘組織培養(yǎng)[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010(4)：46-48.

[4]劉淑蘭，呂秀蓮，王曉軍，等.越橘的化學(xué)成分與藥理話性研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2006，34( 6)：53-54.

[5]于清云，劉晰哲，于海峰.大興安嶺藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的建議[J].中國(guó)林副特產(chǎn)，2008(4)：95.

[6]張玉萍.越橘的保健作用及其在我國(guó)的開發(fā)利用前景[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34(4)：22-25.

[7]唐啟義，馮明光.實(shí)用統(tǒng)計(jì)分析及其DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)[M].北京：科學(xué)出版社，2002.

[8]哈特曼，凱斯特.植物繁殖原理和技術(shù)[M]，鄭開云譯.中國(guó)林業(yè)出版社，1981.

[9]黃卓忠，嚴(yán)華兵.試管苗瓶外生根技術(shù)[J]，廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，38(2)：124-126.

[10]趙玉芬，徐強(qiáng)，孟維英.試管苗瓶外生根技術(shù)[J]，河北林業(yè)科技，2004(2)：50.

[11]張?jiān)谑?，王秀華.越桔組織培養(yǎng)的相關(guān)研究[J].森林工程，2011，27(6)：23-25.

[責(zé)任編輯：胡建偉]