不穩(wěn)定型心絞痛患者血液標(biāo)本保存時(shí)間對(duì)血漿miRNAs檢測(cè)水平的影響

李云1,2，宋銀宏2，呂云波1，秦琴1

(1三峽大學(xué)人民醫(yī)院，湖北宜昌 443000；2三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

摘要：目的探討血液標(biāo)本保存時(shí)間對(duì)不穩(wěn)定型心絞痛患者血漿中miRNAs(miRNA-21、miRNA-24、miRNA-126、miRNA-146、miRNA-223)檢測(cè)水平的影響，確定其檢測(cè)時(shí)間窗。方法選取6例接受冠脈造影檢查的不穩(wěn)定型心絞痛患者，造影時(shí)抽取外周動(dòng)脈血分裝于6支EDTA抗凝管中，每管2 mL；其中3管立即離心分離血漿，4 ℃冰箱保存；余3管全血放入4 ℃冰箱保存。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)方法，3管血漿分別于即刻(0 h)、24 h、1周后檢測(cè)miRNAs水平，3管全血分別于4、24 h及1周后離心獲得血漿再檢測(cè)miRNAs水平，比較各時(shí)間段血漿miRNAs水平的差異。結(jié)果①與0 h時(shí)比較，血液標(biāo)本即刻離心保存24 h后血漿miRNA-21、miRNA-24、miRNA-126、miRNA-223水平下降(P均<0.05)，1周后血漿5種miRNA水平均明顯下降(P均<0.05)。②與0 h時(shí)比較，全血保存4 h后離心分離檢測(cè)血漿miRNA-21水平下降(P<0.05)，24 h后血漿5種miRNA水平均下降(P均<0.05)。結(jié)論 不穩(wěn)定型心絞痛患者保存不同時(shí)間血漿中miRNAs穩(wěn)定性不一；其中血漿miRNA-21穩(wěn)定性最差，需取血后即刻檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：心絞痛，不穩(wěn)定型；血液標(biāo)本；保存時(shí)間；miRNAs

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.41.004

中圖分類號(hào)：R541.1;R33

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2015)41-0010-03

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of blood-preserving time on the expression of miRNAs (miRNA-21, miRNA-24, miRNA-126, miRNA-146 and miRNA-223 ) in the plasma of patients with unstable angina pectoris (UAP), and to make sure the time window for checking their expression in plasma clinically. MethodsSix UAP patients who accepted coronary angiography were selected as subjects. The peripheral blood (PB) samples of the patients were collected in EDTA anticoagulant tubes and separated into 6 tubes (2 ML in each). During the six tubes, the plasma of 3 tubes were separated, and was preserved at 4℃, the other 3 tubes were preserved at 4 ℃.The levels of miRNAs were detected in the 3 tubes at the moment of centrifugation (0 h), 24 h and one week later by real-time fluorescent quantitative PCR. The same procedures were conducted in the other 3 tubes of whole blood after the plasma was collected. The levels of plasma miRNAs were compared at different time points.Results① The concentrations of miRNA-21, miRNA-24, miRNA-126 and miRNA-223 in plasma were decreased significantly after being stored for 24 h as compared with the moment of 0 h(all P<0.05). The concentrations of all the 5 miRNAs in plasma were decreased significantly after being stored for one week as compared with that of 24 h(P<0.05). ② The concentration of miRNA-21 in plasma was decreased significantly after being stored for 4 hours as compared with that of 0 h(P<0.05)，and the concentrations of 5 miRNAs in plasma were decreased significantly after being stored for 24 h (P<0.05). ConclusionThere are differences among the stabilities of different miRNAs in plasma of UAP patients, and miRNA-21 must be examined immediately owing to its poor stability.

基金項(xiàng)目：三峽大學(xué)2013年青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目(KJ2013A012)。

作者簡(jiǎn)介：第一李云(1977-)，女，主治醫(yī)師，碩士，研究方向?yàn)閙iRNA與心血管疾病。E-mail：2640217250@qq.com 通信宋銀宏(1972-)，女，副教授，博士，研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槟[瘤免疫。E-mail：2646561487@qq.com

收稿日期：(2015-08-03)

Effect of blood-preserving time on expression of miRNAs in plasma

of patients with unstable angina pectoris

LIYun1,SONGYin-hong,LYUYun-bo,QINQin

(1ThePeople′sHospitalofThreeGorgesUniversity,Yichang443000,China)

Key words: angina, unstable; blood specimens; preserving time; miRNAs

目前，許多關(guān)于microRNAs(miRNAs)作為臨床疾病診斷標(biāo)志物的研究，均要求標(biāo)本2 h內(nèi)送檢；然而在實(shí)際臨床工作中有時(shí)難以滿足這一時(shí)間要求。為了明確血液標(biāo)本保存時(shí)間對(duì)miRNAs檢驗(yàn)結(jié)果的影響，我們分別觀察獲取血液標(biāo)本立即離心分離血漿后保存不同時(shí)間血漿的miRNAs水平以及全血保存不同時(shí)間離心分離血漿的miRNAs水平，探討不同檢測(cè)時(shí)間對(duì)血漿miRNAs水平的影響。

1資料與方法

1.1臨床資料選擇 2014年10月～2015年1月宜昌市人民醫(yī)院行冠狀動(dòng)脈(冠脈)造影檢查不穩(wěn)定型心絞痛患者6例，其中男4例、女2例，年齡(59.7±4.7)歲。入選患者均有典型的不穩(wěn)定型心絞痛癥狀并冠脈造影檢查陽(yáng)性(單支主干血管或主要分支病變狹窄≥50%)，并排除急性心肌損傷、急性感染、肝腎功能不全、腫瘤、風(fēng)濕免疫性疾病及傳染病?；颊咄獗狙芯坎⒑炇鹬橥鈺?shū)，該研究獲得宜昌市倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2檢測(cè)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)冠脈造影時(shí)取患者外周動(dòng)脈血14 mL，分裝6支EDTA抗凝管中，每管2 mL。其中3管立即離心分離血漿，4 ℃冰箱保存；余3管全血放入4 ℃冰箱保存。3管血漿分別于即刻(0 h)、24 h、1周后檢測(cè)miRNA水平。3管全血分別于4 h、24 h及1周后離心分離獲得血漿再檢測(cè)miRNA水平。

1.2.2血漿miRNAs檢測(cè)分離血漿后用 Tiangen公司生產(chǎn)的提取分離試劑盒分離提取血漿RNA并加尾，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。RNA加Poly(A)尾反應(yīng)體系為：總RNA 10μL、E coli Poly(A) 聚合酶0.4 μL (5 U/μL)、10×Poly(A) 聚合酶緩沖液 2 μL、5×rATP溶液 4 μL、無(wú)RNA酶水 3.6 μL；反應(yīng)條件為37 ℃、60 min；逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的反應(yīng)體系為：Poly(A)反應(yīng)液2 μL、10×RT Primer 2 μL、10×RT 緩沖液 2 μL、超純 dNTPs 1 μL、RNasin 1 μL(40 U/μL)、Quant Rtase 0.5 μL、無(wú)RNA酶水11.5 μL；反應(yīng)條件為37 ℃、60 min。以miRNA-16作為內(nèi)參[1~3]，用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)不同保存時(shí)間血液標(biāo)本中miRNA-21、miRNA-24、miRNA-126、miRNA-146、miRNA-223表達(dá)水平。miRNA-16的上游引物為5′-GATAGCAGCAGGTAAACATTGGCG-3′；miRNA-21的上游引物為5′-CGCCTACCTTATGAGACTGATGTTGAA-3′；miRNA-24的上游引物為5′-TGGCTCAGGTCAG CAGGAACAG-3′；miRNA-126的上游引物為5′-CCTCGTTCCGTGAGTAATAATGCG-3′；miRNA-146的上游引物為5′-CGATGAGAACTGAAATCCTTGGGTTA-3′；miRNA-223的上游引物為5′- TCCTGTCAGTCTGTCAAATACCCCA-3′；下游引物由試劑盒提供。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min，主循環(huán)為94 ℃變性20 s，60 ℃退火延伸34 s，共45個(gè)循環(huán)。計(jì)算3個(gè)復(fù)孔平均值作為每個(gè)樣本實(shí)際 Ct 值，將同一樣本 Ct 值減去其內(nèi)參 Ct 值，得到ΔCt 值。運(yùn)用miRNA表達(dá)倍數(shù)改變值2-ΔΔCt對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行分析[4，5]，ΔΔCt=ΔCt處理樣本-ΔCt對(duì)照樣本，將最后得到的2-ΔCt值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用 SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。檢測(cè)數(shù)據(jù)以±s表示，不同時(shí)間段檢測(cè)miRNAs數(shù)據(jù)比較采用單變量重復(fù)測(cè)量方差分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1即刻分離血漿后保存不同時(shí)間血漿miRNAs水平與0 h時(shí)比較，24 h血中miRNA-21、miRNA-24、miRNA-126、miRNA-223水平下降(P均<0.05)，血漿miRNA-146水平改變無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；1周后血漿中5種miRNAs水平均明顯下降(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1　 即刻分離血漿后保存不同時(shí)間血漿

miRNAs水平比較( n=6, ± s)

表1　 即刻分離血漿后保存不同時(shí)間血漿

檢測(cè)時(shí)間miRNA-21miRNA-24miRNA-126miRNA-146miRNA-2230h0.301±0.1030.060±0.0230.621±0.4300.090±0.0321.328±1.02324h0.153±0.080*0.025±0.011*0.104±0.085*0.048±0.0210.216±0.101*1周0.002±0.001*0.003±0.001*0.001±0.001*0.002±0.001*0.001±0.001*

注:與0 h相比,*P<0.05。

2.2全血保存不同時(shí)間分離血漿miRNAs水平與0 h時(shí)比較，4 h離心分離檢測(cè)血漿miRNA-21水平下降(P<0.05)，24 h血漿miRNA-24、miRNA-126、miRNA-146、miRNA-223水平下降(P均<0.05)；1周后血漿miRNA-223水平回升，與0 h相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2　 全血保存不同時(shí)間分離血漿miRNAs

水平比較( n=6, ± s)

表2　 全血保存不同時(shí)間分離血漿miRNAs

檢測(cè)時(shí)間miRNA-21miRNA-24miRNA-126miRNA-146miRNA-2230h0.301±0.1030.060±0.0230.621±0.4300.090±0.0321.328±1.023全血保存 4h0.065±0.012*0.042±0.0130.112±0.0370.063±0.0250.802±0.335 24h0.039±0.017*0.013±0.007*0.073±0.017*0.019±0.010*0.522±0.248* 1周0.027±0.008*0.026±0.012*0.071±0.017*0.008±0.007*1.205±1.098

注：與0 h相比*P<0.05。

3討論

miRNAs是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類高度保守的小分子單鏈RNA，廣泛存在于人體的各種組織，能通過(guò)非特異性識(shí)別靶基因mRNA3′UTR 區(qū)域使 mRNA 降解、抑制或激活，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生物功能。miRNAs的異常與人類多種疾病密切相關(guān)，如高血糖可通過(guò)下調(diào)miRNA-223、miRNA-146a促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化及血栓的形成。急性心肌梗死時(shí)血漿中miRNA-208a、miRNA-146、miRNA-1水平明顯增高，并且增高的幅度與心肌梗死面積有關(guān)[6,7]，提示miRNAs異?？梢砸鸹蝾A(yù)示相應(yīng)的病理生理改變。研究發(fā)現(xiàn),miRNAs不僅存在于細(xì)胞內(nèi)還能釋放入血，并在血液及體液中穩(wěn)定存在。已知miRNAs能和微泡、蛋白質(zhì)、脂蛋白復(fù)合體結(jié)合抵抗酸堿及核酸酶的破壞并能反復(fù)凍融，提示miRNAs可作為一種新的生物標(biāo)志物[8~10]。

外周血中RNA的穩(wěn)定性較差，極易被細(xì)胞內(nèi)外的核酸酶降解。而血漿中的miRNAs由于和微泡、蛋白質(zhì)、脂蛋白復(fù)合體結(jié)合在一起能抵抗核酸酶及酸堿的破壞，相對(duì)較穩(wěn)定。但是這種結(jié)合并非一成不變，而是一個(gè)動(dòng)態(tài)的平衡過(guò)程。故而血漿標(biāo)本中的miRNAs隨著時(shí)間的推移逐漸被降解。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示不同的miRNAs的穩(wěn)定性不一，5種miRNAs中miRNA-21的穩(wěn)定性較差，考慮與其堿基系列及鍵能較低有關(guān)，5種成熟的miRNAs中miRNA-21的CG堿基水平最低。全血保存4 h后血漿中的miRNA-21水平即有明顯改變，因此需及時(shí)(2 h內(nèi))離心分離檢驗(yàn)。分離血漿后保存24 h后血漿miRNA-146的水平較0 h無(wú)差異，然而全血保存24 h后明顯降低，提示實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差與樣本量偏小有關(guān)。血漿及全血保存24 h后血漿miRNA-21、miRNA-24、miRNA-126、miRNA-223水平均明顯下降，推測(cè)4 ℃miRNAs的血漿保存時(shí)間不能超過(guò)24 h。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)分離血漿后保存與全血保存血漿中5種miRNAs水平隨時(shí)間延長(zhǎng)均為下降趨勢(shì)，但全血保存1周后血漿miRNA-223的水平出現(xiàn)明顯回升，提示血細(xì)胞能影響血漿miRNAs的水平。已知miRNA-21主要存在于血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)，miRNA-24、miRNA-126主要存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，miRNA-146主要存在于單核淋巴細(xì)胞內(nèi)，而miRNA-223主要存在于血小板內(nèi)。成熟的miRNAs主要存在于細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞壞死時(shí)胞質(zhì)內(nèi)的miRNAs釋放入血，導(dǎo)致血漿中的miRNAs水平升高。血管平滑肌細(xì)胞的壽命較長(zhǎng)，而血小板的壽命較短，大約1周左右,不同細(xì)胞的壽命及穩(wěn)定性不一致導(dǎo)致其對(duì)血漿miRNAs水平的影響不一。

冠脈病變及組織缺氧時(shí)細(xì)胞內(nèi)miRNA-21、miRNA-24、miRNA-146的表達(dá)上調(diào)從而調(diào)節(jié)血管的增殖及新生內(nèi)膜的形成，同時(shí)影響動(dòng)脈斑塊的穩(wěn)定性[11～13]。而不穩(wěn)定型心絞痛的病理學(xué)基礎(chǔ)是冠脈的不穩(wěn)定斑塊，因此miRNA-21、miRNA-24、miRNA-146的水平直接影響不穩(wěn)定型心絞痛患者的病程及預(yù)后。冠脈病變時(shí)血漿miRNA-126水平下降，miRNA-126或可作為冠心病血管損傷的生物標(biāo)志物。miRNA-223富含于血小板中，可作用于受體蛋白相應(yīng)的mRNAs從而參與血小板黏附、聚集、激活的過(guò)程，調(diào)節(jié)血小板的活化，在血栓性心腦血管疾病發(fā)生、發(fā)展的病理生理過(guò)程中起著非常重要的作用。因此血漿miRNAs的檢測(cè)對(duì)不穩(wěn)定型心絞痛患者的診治意義重大。

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