干擾P2X7R基因?qū)AW264.7細胞增殖和吞噬的影響*

蘇程程1,3▲，張譯丹1▲，馬永強2，陳雪芬1，向國安1，周欣2，彭守春1，林志春2，魏路清1△，姬文婕1△

(1中國人民武裝警察部隊后勤學院附屬醫(yī)院呼吸與重癥醫(yī)學科,2天津市心血管重塑與靶器官損傷重點實驗室，天津 300162;3河北醫(yī)科大學，河北 石家莊 050017)

[摘要]目的： 應用RNA干擾技術抑制小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞P2X7受體(P2X7R)基因的表達，建立穩(wěn)定干擾細胞株，并觀察其對細胞增殖和凋亡的影響。方法: 用脂質(zhì)體法將P2X7R shRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至RAW264.7細胞，經(jīng)G418篩選后獲得穩(wěn)定干擾細胞株。細胞分為野生型(WT)組、陰性對照(NC)組和干擾(shP2X7R)組。Real-time PCR法檢測細胞中P2X7R mRNA的表達，Western blot檢測細胞中P2X7R蛋白的表達；CCK-8方法檢測細胞生長活性，5-乙炔基-2’-脫氧尿苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine，EdU)摻入實驗檢測細胞增殖活性；流式細胞術分析細胞周期的分布和吞噬情況。結果: P2X7R shRNA能明顯抑制RAW264.7細胞的P2X7R mRNA和蛋白的表達，抑制率在80%以上。48 h后，shP2X7R組細胞的生長速度明顯高于NC組和WT組 (P<0.05)，增殖期細胞比例明顯升高 (P<0.05)，說明下調(diào)P2X7R基因能明顯促進細胞增殖。shP2X7R組的細胞周期出現(xiàn)改變，S期和G2/M期的比例明顯上升，增殖指數(shù)增高 (P<0.05)。shP2X7R組的細胞吞噬活性明顯高于NC組(P<0.05)。結論: 本研究成功構建了穩(wěn)定干擾P2X7R基因表達的小鼠巨噬細胞株RAW264.7，shP2X7R能夠明顯促進RAW264.7細胞的增殖，改變了細胞的吞噬活性。

[關鍵詞]P2X7受體； RNA干擾； RAW264.7巨噬細胞； 細胞增殖； 細胞吞噬

[中圖分類號]R363[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.11.023

[文章編號]1000-4718(2015)11-2070-06

[收稿日期]2015-07-20[修回日期] 2015-09-23

[基金項目]*廣東省科技社會發(fā)展項目(No. 2012B031800030)

通訊作者△Tel： 020-81332309； E-mail: qkchen@21cn.com

Effect ofP2X7R gene silencing by RNA interference on proliferation and phagocytosis of murine macrophage cell line RAW264.7SU Cheng-cheng1, ZHANG Yi-dan1, MA Yong-qiang2, CHEN Xue-fen1, XIANG Guo-an1, ZHOU Xin2, PENG Shou-chun1, LIN Zhi-chun2, WEI Lu-qing1, JI Wen-jie1

(1DepartmentofRespirologyandCriticalCareMedicine,LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForces，2TianjinKeyLaboratoryofCardiovascularRemodelingandTargetOrganInjuryInstituteofCardiovascularDiseaseandHeartCenterTianjin300162,China;3HebeiMedicalUniversity,Shijazhuang050017China.E-mail:ji_wenjie@hotmail.com;wei_luqing@hotmail.com)

ABSTRACT[]AIM: To establish a cell line of stable silencing of P2X7 receptor (P2X7R) expression through short hairpin RNA (shRNA)-mediated interference in murine RAW264.7 macrophages, and to investigate the proliferation and apoptosis in the cell line. METHODS: Stable silencing of P2X7R gene in the RAW264.7 cells was achieved by recombinant shRNA plasmid targeting murine P2X7R gene via liposome mediated transfection, followed by G418 selection. The efficacy of plasmid transfection and P2X7R silencing in G418 resistant cells was verified by immunofluorescent microscopy and real-time PCR, respectively. The proliferative activity was analyzed by CCK-8 assay and EdU cell proliferation assay. The cell cycle distribution and apoptosis were evaluated by flow cytometry. RESULTS: The expression of P2X7R at mRNA and protein levels was down-regulated by 80% in shP2X7R group compared with negative control (NC) plasmid transfection. In addition, P2X7R-silencing cells exhibited higher proliferative activity compared with NC and wild-type RAW264.7 cells (P<0.05). Compared with NC cells, P2X7R silencing resulted in an increase in the phagocytosis of the cells (P<0.05). CONCLUSION: A cell line RAW264.7 of stable silencing of P2X7R expression was successfully established. P2X7R gene silencing stimulates the proliferation, and changes phagocytic function in murine RAW264.7 macrophages.

[KEY WORDS]P2X7receptor; RNA interference; RAW264.7 macrophages; Cell proliferation; Cell phagocytosis

巨噬細胞是天然免疫應答的重要細胞成份，由于其組織分布、分化程度以及外界激活因子的多樣性，巨噬細胞具有復雜的異質(zhì)性與功能的多樣性。不同的環(huán)境中，巨噬細胞可以具有不同的激活途徑，主要有經(jīng)典激活的M1表型分泌促炎細胞因子，替代激活的M2表型分泌抗炎因子并與損傷修復有關。在以慢性炎癥為特征的某些疾病及其病理過程中，均觀察到巨噬細胞活化表型的變化。目前研究發(fā)現(xiàn)，P2X7受體(P2X7receptor，P2X7R)不僅通過與三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)結合刺激細胞因子類的合成和分泌，誘導炎癥反應和巨噬細胞表型的偏移等[1-3]，而且P2X7R還參與了介導細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導[4]。本研究采用RNA干擾技術，構建穩(wěn)定干擾P2X7R基因的小鼠巨噬細胞RAW264.7，觀察干擾后其增殖和凋亡等生物學特性的變化，為進一步探討P2X7R對巨噬細胞的調(diào)控作用及其機制，提供有力的分子生物學工具。

材料和方法

1主要試劑

RAW264.7細胞(南開大學生命科學院韓際宏教授惠贈)；高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(Hyclone)；G-418(Amesco)；OPTI MEM轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基、LipofectamineTM2000、TRIzol(Invitrogen)；CCK-8試劑盒(Dojindo)；MMLV反轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs(Promega)；SYBR GreenPCR試劑盒、蛋白酶抑制劑(Roche)；EdU-Click 488細胞增殖檢測試劑盒、碘化丙啶(Sigma)；AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑盒(Biolegend)；BCA蛋白定量試劑盒(Pierce)；GAPDH小鼠單克隆抗體、P2X7R小鼠單克隆抗體(Abcam)；HRP標記山羊抗小鼠IgG(Abgent)；PVDF膜、ECL化學發(fā)光試劑盒(Millipore)；干擾表達載體系統(tǒng)(上海吉瑪制藥技術有限公司)；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2方法

2.1細胞培養(yǎng)小鼠巨噬細胞株RAW264.7用高糖DMEM培養(yǎng)基(含12%胎牛血清、4 mmol/L 谷氨酰胺)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

2.2P2X7R穩(wěn)定干擾細胞株的建立分別將攜帶P2X7R短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)和陰性對照(negative control，NC)的重組質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo，按照LipofectamineTM2000說明書進行細胞轉(zhuǎn)染，簡述如下：將對數(shù)生長期的RAW264.7細胞計數(shù)后接種于6孔板，每孔4×105個，使轉(zhuǎn)染時細胞達到80%～90%的融合。細胞分為野生型(wild type，WT)組、NC組和轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-P2X7R(RNA interference by P2X7R-shRNA, shP2X7R)組。質(zhì)粒DNA用量為每孔4 μg，轉(zhuǎn)染后36 h用G418(500 mg/L)篩選轉(zhuǎn)染細胞，然后挑取單克隆進行擴大培養(yǎng)，傳代3次以上，real-time PCR法和Western blot法檢測P2X7R的干擾效果，若細胞狀態(tài)穩(wěn)定，則表明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系構建成功。

2.3Real-time PCR法檢測細胞中P2X7R mRNA的表達情況按照TRIzol說明書提取各組細胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后用SYBR Green法進行PCR擴增，同一樣本設2個復孔，實驗重復3次。P2X7R正義鏈為5’-CAGTCACTGGAGGAACTGGAA-3’，反義鏈為5’-CCAAAGGAAACACACCGATT-3’，擴增產(chǎn)物長度為77 bp ；β-actin正義鏈為5’-CTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3’，反義鏈為5’-ACCAGAGGCATACAGGGACA-3’，擴增產(chǎn)物長度為104 bp 。擴增條件為：50 ℃ 2 min， 95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1min，共40個循環(huán)。以上引物均由北京三博遠志生物技術有限公司合成。用2-ΔΔCt法對擴增結果進行分析。

2.4Western blot法檢測細胞中P2X7R蛋白的表達情況分別提取各組細胞總蛋白，采用BCA法定量蛋白濃度，將經(jīng)過95 ℃ 10 min變性處理的蛋白樣品進行SDS-PAGE，半干法轉(zhuǎn)膜；5%的脫脂奶粉溶液封閉，分別加入GAPDH小鼠單克隆抗體(1∶1 000)、P2X7R小鼠單克隆抗體(1∶2 000)，4 ℃過夜；次日加入HRP標記山羊抗小鼠IgG，室溫孵育1 h，PBST洗滌15 min 3次；ECL化學底物發(fā)光法顯色，Image Lab 4.0軟件進行圖像灰度分析， P2X7R的蛋白相對表達量用其與GAPDH的灰度比值表示。

2.5CCK-8測定細胞生長水平分別將對數(shù)生長期的WT組、NC組和shP2X7R組RAW264.7細胞計數(shù)后，接種于96孔板，每孔103個，每組均設6個復孔，分別于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h后，每孔加入CCK-8 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，測定450 nm波長處吸光度(A)值。實驗重復3次，計算平均值，根據(jù)各組細胞每天的A值繪制細胞生長曲線。

2.6EdU法檢測細胞增殖活性按照EdU細胞檢測試劑盒的操作說明進行，簡述如下：分別接種對數(shù)生長期的WT組、NC組和shP2X7R組RAW264.7細胞于12孔細胞培養(yǎng)板中，每孔接種2×105個細胞，在培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h后，換含10 μmol/L EdU的培養(yǎng)基1 mL，孵育1 h后，4%多聚甲醛固定15 min，0.5% Triton X-100室溫破膜20 min，加入click-reaction mixture(含1 mol/L pH 8.5 Tris-HCl 50 μL，25 mmol/L CuSO420 μL，10 mmol/L 6-FAM-Azide 2.5 μL，0.5 mol/L抗壞血酸50 μL，去離子水補足體系至500 μL)室溫避光孵育30 min，然后用DAPI染DNA，最后用Leica DMZ 3000熒光顯微鏡觀察并采集圖像。每個樣本隨機選取10個視野，細胞增殖率按照高倍視野下EdU陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比計算。

2.8流式細胞術檢測細胞吞噬活性按照熒光素標記大腸桿菌吞噬試劑盒操作說明進行測定。簡述如下：取各組對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞密度為1×109/L，接種于96孔板，每孔105個細胞，每組設3個復孔。0.5 mL HBSS與熒光素標記的E.colik-12微粒超聲混勻后，移入含4.5 mL Milli Q水的棕色小瓶中，再次超聲充分混勻。每孔加入100 μL微粒懸液，輕輕混勻，CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h后，去除上清，加入100 μL 0.25 g/L臺盼藍溶液1 min，吸出上清，加入培養(yǎng)基，收集細胞懸液，Beckman Coulter FC500流式細胞儀分析，計算各組細胞的平均熒光強度(mean fluorescence intensity，MFI)，表示吞噬活性的強弱。

3統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示。組間的比較采用t檢驗和單因素方差分析，各組均數(shù)多重比較采用Tukey’s法。單變量配對資料之間的比較采用配對樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1P2X7R mRNA和蛋白的表達水平

用2-ΔΔCt法對PCR結果進行分析，shRNA組的P2X7R mRNA水平明顯低于WT組和NC組(P<0.05)，抑制率為80%左右，而NC組和WT組之間差異不顯著；Western blot結果表明，與NC組相比，shP2X7R組的P2X7R蛋白表達水平明顯下調(diào)(P<0.05)，而NC組和WT組之間的P2X7R蛋白表達水平無明顯變化。上述結果說明成功構建了P2X7R穩(wěn)定干擾細胞株，見圖1、2。

Figure 1.The mRNA expression of P2X7R in the RAW264.7 cells determined by real-time PCR analysis. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vsNC and WT.

圖1各組RAW264.7細胞中P2X7R mRNA的表達

Figure 2.The protein expression of P2X7R in the RAW264.7 cells determined by Western blot. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vsNC and WT.

圖2各組RAW264.7細胞中P2X7R 蛋白的表達

2P2X7R shRNA對RAW264.7細胞生長的影響

如細胞生長曲線所示，WT組和NC組之間的細胞增殖活性沒有顯著差異，而48 h后，shP2X7R組細胞的生長明顯高于前2組(P<0.05)，說明下調(diào)P2X7R基因能明顯促進細胞生長，見圖3。

Figure 3.Cell growth curve of RAW264.7 cells obtained by CCK-8 assay. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vsNC and WT.

圖3P2X7R shRNA對RAW264.7細胞生長水平的影響

3P2X7R shRNA對RAW264.7細胞增殖活性的影響

EdU法檢測結果如圖4所示，與NC組相比，shP2X7R組的細胞增殖活性明顯升高(P<0.05)，NC組和WT組比較無明顯差異。說明下調(diào)P2X7R基因能明顯提高細胞的增殖活性。

4P2X7R shRNA對RAW264.7細胞周期的影響

與WT組和NC組相比，shP2X7R組的細胞周期分布出現(xiàn)改變，G0/G1期比例降低，S期和G2/M期的比例增高，增殖指數(shù)明顯升高(P<0.05)；而WT組與NC組的細胞周期分布無明顯差異，見表1。

Figure 4.Detection of EdU incorporated into the DNA of RAW264.7 cells by fluorescence microscopy. Mean±SEM.n=3.*P<0.05，**P﹤0.01vsNC and WT.

圖4EdU法檢測P2X7R shRNA對RAW264.7細胞增殖活性的影響

表1　各組細胞周期的分布及增殖指數(shù)的變化

*P<0.05vsWT and NC.

5P2X7R shRNA對RAW264.7細胞吞噬活性的影響

小鼠巨噬細胞RAW264.7吞噬FITC標記的大腸桿菌后流式分析結果顯示，各組細胞的平均熒光強度分別為：WT組(120.0±3.61)、NC組(47.66±6.78)和shP2X7R組(82.97±8.69)。WT組的細胞吞噬活性最強，其次是shP2X7R組，而NC組的吞噬活性最弱，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖5。由于NC轉(zhuǎn)染引起細胞吞噬功能下降。因此該結果尚需后續(xù)實驗進一步驗證。

討論

巨噬細胞是研究細胞吞噬、細胞免疫和分子免疫學的重要對象，在不同環(huán)境中，巨噬細胞可以發(fā)生不同性質(zhì)的活化，成為具有不同分子表型和功能特征的亞群，從而決定了其在各種環(huán)境和不同疾病中發(fā)揮的作用[5]。目前認為巨噬細胞至少存在2種活化狀態(tài)，經(jīng)典活化(M1)和替代活化(M2)。M1巨噬細胞通常認為是經(jīng)干擾素γ激活，主要表現(xiàn)為促進炎癥和氧化應激反應、增強的吞噬活性；M2巨噬細胞主要經(jīng)IL-4和IL-13激活，主要表現(xiàn)為抑制炎癥反應，并與組織的修復和纖維化過程有關[6]。兩種狀態(tài)的平衡對于機體維持正常的免疫功能是必須的，任何一種活化失衡狀態(tài)都可能對組織炎癥的恢復產(chǎn)生不良的影響。

P2X7R是一種ATP門控型離子通道，在巨噬細胞、樹突狀細胞和小膠質(zhì)細胞高表達[7]，參與了細胞的多種病理生理過程，包括細胞增殖、分化和凋亡、單核巨噬細胞分泌細胞因子以及細胞介導的細胞毒性作用等[8-11]。細胞外ATP與P2X7R結合引發(fā)的寡聚化反應，使離子通道迅速開放，產(chǎn)生K+外流，引起胞內(nèi)K+的迅速耗竭，進而激活NALP3炎癥復合體。正常情況下，胞外ATP的濃度受到胞外ATP酶和ADP酶的嚴格調(diào)控而處于低水平，出現(xiàn)組織損傷時，ATP大量釋放至細胞外間隙，并以旁分泌的形式通過臨近細胞的P2X7R進一步促發(fā)炎癥反應[7, 12]。因此，通過對P2X7R的調(diào)控，調(diào)節(jié)巨噬細胞功能，可能成為潛在的慢性炎癥及相關疾病的治療和預防靶點之一。

Figure 5.Evaluation of phagocytic function by flow cytometry withE.coli-FITC. Representative histograms of count (y-axis)vsFITC (x-axis) were showed. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vsNC.

圖5shP2X7R對RAW264.7細胞吞噬功能的影響

本研究中采用基于質(zhì)粒載體的shRNA系統(tǒng)，用脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-P2X7R shRNA轉(zhuǎn)染至小鼠巨噬細胞RAW264.7，獲得穩(wěn)定干擾細胞株。實驗結果表明P2X7R shRNA有效地抑制了RAW264.7細胞中P2X7R的 mRNA和蛋白表達，明顯促進了RAW264.7細胞的生長和增殖活性，S期和G2/M期的比例明顯升高。但是目前尚未闡明P2X7R對巨噬細胞的調(diào)控途徑和機制，以及在此過程中與其它信號轉(zhuǎn)導通路之間的相互關系等。因此，本實驗中成功構建的穩(wěn)定干擾細胞株將為進一步探討P2X7R在巨噬細胞相關的病理生理過程的作用和機制，提供有力的研究工具和奠定初步的實驗基礎。

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(責任編輯： 陳妙玲， 余小慧)