■趙 玲 孫然然 朱洛毅 孫鋁輝 齊德生

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢430070）

黃曲霉毒素被認(rèn)為是一種致癌性最強(qiáng)且存在最普遍的一種毒素。如何降低黃曲霉毒素的危害一直是很多科研工作者努力的目標(biāo)。目前國內(nèi)外去除黃曲霉毒素的方法主要有物理法、化學(xué)法以及生物法[1]。其中生物法中的生物降解脫毒法被認(rèn)為是比較高效安全的一種降解方法[2]。本實(shí)驗(yàn)室前期已有報(bào)道，從土壤中篩選出的一種黃曲霉毒素降解菌株經(jīng)鑒定為芬氏纖維微菌（Cellulosimicrobium funkei），屬于纖維微菌屬。將該菌與AFB1一同灌服給雛鴨時(shí)，相比于單獨(dú)灌服AFB1，改善了肉鴨的生長性能，也改善了肉鴨肝臟的損傷程度。結(jié)果表明，該芬氏纖維微菌可以改善受AFB1感染的肉鴨的生長性能以及減緩肝臟的損傷[3]。但是芬氏纖維微菌對于肉鴨盲腸微生物菌群而言屬于外來菌種，它是否會(huì)對盲腸微生物菌群造成影響尚未有研究報(bào)道。本試驗(yàn)就以雛鴨為試驗(yàn)對象，分為5個(gè)處理組，每組均飼喂普通日糧，通過經(jīng)口灌服AFB1、芬氏纖維微菌菌液以及芬氏纖維微菌菌液和AFB1混合物，針對盲腸微生物菌群的變化做相關(guān)檢測及探究。該試驗(yàn)的探究結(jié)果可以為相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供科研依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 試驗(yàn)材料

伊紅-美藍(lán)（EMB）瓊脂、MRS培養(yǎng)基、Wilkins-Chalgren瓊脂、TPY瓊脂（以上均購于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司）；芬氏纖維微菌（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)）；黃曲霉毒素B1(標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥99%，美國Sigma公司)。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及日糧

120只1 日齡櫻桃肉谷鴨（購于武漢市春江禽業(yè)有限責(zé)任公司），基礎(chǔ)日糧預(yù)飼3 d后，選取100只健康、體重相近的雛鴨，隨機(jī)分為5個(gè)組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5只雛鴨。日糧均采用商品日糧，且未檢出黃曲霉毒素

具體分組如下：

對照組：灌服1 ml無菌LB培養(yǎng)基，連續(xù)灌胃14 d

試驗(yàn)組1：C.funkei菌低劑量組，灌服1 ml C.funkei菌液(1×108cfu/ml)，連續(xù)灌胃7 d，第8 d開始停止灌服菌液，只灌服1 ml無菌LB培養(yǎng)基，每天灌胃1次。

試驗(yàn)組2：C.funkei菌高劑量組，灌服1 ml C.funkei菌液（1×1010cfu/ml），連續(xù)灌胃7 d，第8 d開始停止灌服菌液，只灌服1 ml無菌LB培養(yǎng)基。

試驗(yàn)組3：AFB1處理組，按照0.1 mg/(kg·BW)的量灌服AFB1溶液+1 ml無菌LB培養(yǎng)基，連續(xù)灌胃14 d，每天灌胃1次。

試驗(yàn)組4：AFB1+C.funkei菌處理組，按照0.1 mg/(kg·BW)的量灌服AFB1溶液+1 ml無菌LB培養(yǎng)基，連續(xù)灌胃14 d。

各組均飼喂肉鴨商品日糧，且日糧中未檢出黃曲霉毒素

1.3 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗(yàn)在武漢市華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物營養(yǎng)代謝實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。試驗(yàn)肉鴨采用分欄網(wǎng)上平養(yǎng)方式。試驗(yàn)前一周，將鴨舍、鴨籠徹底清掃和沖洗，封好門窗后用高錳酸鉀和福爾馬林熏蒸消毒，3 d后將門窗打開通風(fēng)換氣4 d。肉鴨預(yù)飼期3 d，試驗(yàn)期14 d（即4～17日齡），整個(gè)試驗(yàn)期，每天喂料2次，所有肉鴨自由采食和飲水。每天觀察肉鴨精神、攝食、飲水及死亡等情況。

1.4 樣品采集和處理

分別于試驗(yàn)期第7 d和第14 d，屠宰鴨子，取出兩側(cè)盲腸，用脫脂棉扎口，用于盲腸微生物的測定。

1.5 盲腸微生物指標(biāo)測定

總需氧菌計(jì)數(shù)用LB瓊脂培養(yǎng)基，總厭氧菌計(jì)數(shù)用Wilkins-Chalgren瓊脂，乳酸菌計(jì)數(shù)用MRS瓊脂，大腸桿菌計(jì)數(shù)用伊紅-美藍(lán)瓊脂，雙歧桿菌計(jì)數(shù)用TPY瓊脂。C.funkei用LB瓊脂培養(yǎng)基。采用平板涂布計(jì)數(shù)法進(jìn)行盲腸微生物的計(jì)數(shù)。無菌條件下取0.5 g盲腸內(nèi)容物加入5 ml生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋，然后依次稀釋至10-5或10-6稀釋度，從適宜的稀釋度中吸取100 μl均勻涂布于瓊脂平板，然后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。其中，乳酸菌、雙歧桿菌和總厭氧菌在厭氧條件下培養(yǎng)48 h，大腸桿菌需氧培養(yǎng)24 h，C.funkei細(xì)菌和總需氧菌在有氧條件下培養(yǎng)48 h。

1.6 數(shù)據(jù)處理

各組數(shù)據(jù)經(jīng)過Excel 2007初步處理后，利用SAS8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan's多重比較進(jìn)行差異顯著性分析，當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為有顯著性差異，所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示（M±SD）。

2 結(jié)果

2.1 降解菌株對肉鴨盲腸微生物菌群的影響(見表1、表2)

不同處理對腸道中大腸桿菌的數(shù)量均有影響。與對照組相比，試驗(yàn)組1，2均可以顯著降低雛鴨盲腸中大腸桿菌的數(shù)量（P＜0.05）。而對腸道中乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量沒有影響（P＞0.05）。試驗(yàn)組2會(huì)使總需氧菌和總厭氧菌的數(shù)量顯著升高（P＜0.05）。

表14 ～10 d雛鴨盲腸內(nèi)容物微生物含量[log10（cfu/g內(nèi)容物）]

表211 ～17 d雛鴨盲腸內(nèi)容物微生物含量[log10（cfu/g內(nèi)容物）]

在試驗(yàn)第14 d檢測雛鴨盲腸內(nèi)主要微生物的數(shù)量變化，與對照組相比，試驗(yàn)組1,2的各盲腸微期生物的數(shù)量與對照組均沒有差異（P＞0.05）。而且也未檢測出芬氏纖維微菌的殘留。

2.2 芬氏纖維微菌菌株對AFB1暴露下雛鴨盲腸微生物菌群的影響(見表3、表4)

表34 ～10 d雛鴨盲腸內(nèi)容物微生物含量[log10（cfu/g內(nèi)容物）]

表411 ～17 d雛鴨盲腸內(nèi)容物微生物含量[log10（cfu/g內(nèi)容物）]

與對照組相比，試驗(yàn)組3使腸道內(nèi)大腸桿菌的數(shù)量顯著升高（P＜0.05），使乳酸桿菌的數(shù)量顯著降低（P＜0.05）。而試驗(yàn)組4各項(xiàng)微生物指標(biāo)與對照組均無顯著差異（P＞0.05）。

與對照組相比，試驗(yàn)組3、4均會(huì)使大腸桿菌的數(shù)量顯著升高（P＜0.05），但是試驗(yàn)組3使大腸桿菌數(shù)量增加的幅度更大。試驗(yàn)組3使腸道中總需氧菌顯著增加（P＜0.05），使乳酸桿菌的數(shù)量顯著降低（P＜0.05），對總厭氧菌和雙歧桿菌的數(shù)量沒有顯著影響（P＞0.05）。試驗(yàn)組4與對照組相比，各項(xiàng)微生物指標(biāo)均無顯著差異（P＞0.05）。

由以上結(jié)果可知，雛鴨灌服AFB1后，可引起盲腸大腸桿菌數(shù)量上升、乳酸菌數(shù)量降低，造成盲腸微生物區(qū)系紊亂。對于AFB1暴露雛鴨，添加芬氏纖維微菌可以降低大腸桿菌和總需氧菌的數(shù)量，在一定程度上可以改善盲腸微生物區(qū)系。

3 討論

3.1 芬氏纖維微菌對肉鴨盲腸微生物的影響

動(dòng)物腸道菌群組成最大決定因素是飼糧，腸道微生物菌群組成受到飼料原料，飼糧脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物營養(yǎng)水平，飼糧物理結(jié)構(gòu)（顆粒大小和加工技術(shù)），外源飼用酶類以及飼用抗生素（抗生素和抗球蟲藥）使用的影響[4]。當(dāng)外源添加微生物在動(dòng)物飼料中時(shí)，應(yīng)保證外來微生物不會(huì)造成動(dòng)物腸道微生物菌群的紊亂。飼用微生物主要特點(diǎn)之一是可以改善宿主腸道微生態(tài)平衡。動(dòng)物體內(nèi)的大腸桿菌是機(jī)體必不可少的細(xì)菌，屬于動(dòng)物腸道的正常菌群，但是大腸桿菌的某些致病菌株會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物腹瀉及其它多種炎癥，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[5]。動(dòng)物體內(nèi)還有一類可以改善宿主腸道健康的菌群—益生菌。益生菌種類很多，主要包括乳酸菌、腸球菌、雙歧桿菌、片球桿菌、芽孢桿菌、埃希氏桿菌、乳球菌、大量的酵母菌及混合培養(yǎng)物等[6]。存在于動(dòng)物腸道的益生菌主要有乳酸菌和雙歧桿菌。乳酸菌和雙歧桿菌是維持動(dòng)物腸道健康的重要菌群，它們可以與其它厭氧菌共同作用占據(jù)腸粘膜表面，形成保護(hù)性的生物屏障，阻止有害菌的侵入定植[7]。

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，對雛鴨連續(xù)灌服芬氏纖維微菌一周可以降低盲腸內(nèi)容物中大腸桿菌的數(shù)量，對雛鴨灌服芬氏纖維微菌對乳酸菌和雙歧桿菌沒有影響。這可能是因?yàn)榉沂侠w維微菌的胞外代謝產(chǎn)物有抑菌成分，可以抑制大腸桿菌的生長。另外，在動(dòng)物腸道內(nèi)存在微生物奪氧機(jī)制，當(dāng)好氧或兼性厭氧菌進(jìn)入腸道后，在生長繁殖過程中可消耗腸道內(nèi)的氧氣，降低腸道內(nèi)氧氣濃度，抑制其它需氧菌的生長，促進(jìn)厭氧菌的生長，從而維持腸道微生態(tài)區(qū)系的平衡[8]。芬氏纖維微菌屬于兼性厭氧菌，在生長繁殖過程中可能也存在上述奪氧機(jī)制，從而抑制了需氧菌大腸桿菌的生長。在本試驗(yàn)中對雛鴨灌服1010cfu/d的芬氏纖維微菌盲腸總厭氧菌和總需氧菌均顯著上升，分析原因可能是因?yàn)樵摼陮儆诩嫘詤捬蹙谟醒鹾蛥捬鯒l件下均可生長，在測定總需氧菌和總厭氧菌時(shí)均含有大量芬氏纖維微菌菌落，從而使這兩項(xiàng)指標(biāo)顯著升高。

動(dòng)物腸道內(nèi)膽鹽、胃內(nèi)低pH環(huán)境以及其它酶類對微生物都有潛在的滅活作用[9]。飼用微生物對其具有一定的耐受性才能在胃腸道生長繁殖從而發(fā)揮生理功能[10]。本試驗(yàn)在雛鴨盲腸內(nèi)容物中檢測到芬氏纖維微菌說明該菌株經(jīng)過胃腸道酸堿環(huán)境后可以存活，可以耐受動(dòng)物胃腸道環(huán)境，為以后在動(dòng)物飼料中的應(yīng)用提供了依據(jù)。同時(shí)，對雛鴨停止灌服該菌一周后，在盲腸內(nèi)沒有檢測到該菌，說明該菌株是胃腸道的過路菌，無法在腸道定植。

3.2 AFB1對肉鴨盲腸微生物的影響以及芬式纖維微菌對AFB1暴露肉鴨的盲腸微生物區(qū)系的改善作用

前期的研究結(jié)果表明，給雛鴨灌服AFB1，雛鴨的日增重明顯下降，料重比增大，生長性能受到影響，AFB1的毒性作用會(huì)嚴(yán)重影響到肉鴨的生產(chǎn)。雛鴨在第一周肝臟出現(xiàn)腫脹，大面積的變性、壞死，毒素?cái)z入一周后，近1/2肝組織被增生的膽管樣細(xì)胞取代，兩周后，接近4/5肝組織被增生的膽管樣上皮細(xì)胞取代，說明AFB1對雛鴨肝損傷極為嚴(yán)重[3]。

動(dòng)物的肝功能狀態(tài)與腸道微生態(tài)環(huán)境存在緊密的關(guān)系。肝臟可以清除來自腸道的酚類、氨類以及內(nèi)毒素等物質(zhì)。當(dāng)肝臟出現(xiàn)功能障礙時(shí)，腸道產(chǎn)生的有害物質(zhì)不能被肝臟代謝分解，有害物質(zhì)積存在腸道，使腸道環(huán)境發(fā)生改變，導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)[11]。Li等[12]研究報(bào)道慢性肝病患者會(huì)出現(xiàn)腸道微生態(tài)失衡的癥狀，具體表現(xiàn)為以大腸桿菌為代表的革蘭氏陰性菌增多，而腸道專性厭氧菌顯著減少。

肝臟是AFB1作用的靶器官，在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，AFB1處理組雛鴨與空白對照組相比，大腸桿菌和總需氧菌數(shù)量顯著上升，而有益菌乳酸菌顯著降低，雙歧桿菌也有所降低。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室之前的研究結(jié)果[3]，AFB1導(dǎo)致雛鴨肝臟受損的同時(shí)也使腸道微生態(tài)環(huán)境發(fā)生紊亂。對AFB1暴露雛鴨灌服芬氏纖維微菌可以顯著降低大腸桿菌和總需氧菌的數(shù)量，乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)量也有所上升，說明該菌可使腸道菌群趨于正常。分析其原因，可能是由于該菌可以降解腸道內(nèi)的AFB1，減少了AFB1的吸收。從而可以減輕其對肝臟的損傷作用[3]。

4 結(jié)論

在肉鴨飼糧中添加一定濃度的芬氏纖維微菌可以有效緩解AFB1對肉鴨盲腸微生物的影響，在一定程度上改善肉鴨腸道微生物區(qū)系。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)論可以為相關(guān)的可緩解黃曲霉毒素對畜禽的損害的產(chǎn)品的開發(fā)利用提供科研依據(jù)。