張曉龍+肖靜+王瑞明

摘要：以表達β-甘露聚糖酶的畢赤酵母工程菌為研究對象，采用搖瓶發(fā)酵確定碳源、接種量、溫度、pH基礎條件，通過30 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵，探究菌體濃度、甲醇濃度、甲醇補料方式、溶氧量等條件對目的蛋白產(chǎn)量的影響，并通過正交試驗優(yōu)化發(fā)酵工藝條件。結果表明，最佳產(chǎn)酶條件為接種量10%，初始葡萄糖質量濃度30 g/L，誘導溫度28 ℃，pH 5.0，溶氧量10%～20%。在此發(fā)酵條件下，最終細胞干重135 g/L，目的蛋白表達量5.04 g/L，最高酶活力29 600 U/mL，較優(yōu)化前提高24倍，已滿足工業(yè)化要求。

關鍵詞： β-甘露聚糖酶; 巴斯德畢赤酵母; 高密度培養(yǎng); 發(fā)酵優(yōu)化

中圖分類號：Q815 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2015）23-5978-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.23.047

Optimization Technology of β-Mannanase Fermented by Pichia pastoris

ZHANG Xiao-long，XIAO Jing，WANG Rui-ming

（Institute of Biological Engineering of Qilu University of Technology， Shandong Province Key Laboratory of Microbial Engineering，

Jinan 250353，China）

Abstract：The fermentation conditions of genetically engineered Pichia pastoris for β-Mannanase were studied. Basic conditions of the carbon source， immunization rates， temperature， pH were optimized in shake-flask. The tests in 30 L fermenter was applied to study the effects of DCW，methanol concentration and DO on enzyme production. Through the orthogonal design to optimize the fermentation conditions. The results indicated that the optimum conditions were as follows：10% inoculum size，30 g/L initial glucose concentration， 10%～20% DO，pH 5.0 at 28 ℃. The dry cell weight was 135 g/L，the target protein concentration could reach to 5.04 g/L. And the β-Mannanase activity got to be 29 600 U/mL，which was 24 times of that the results in the shake flask under these conditions.

Key words：β-Mannanase;Pichia pastoris;high cell density culture;fermentation optimization

β-甘露聚糖酶（β-1，4-D-mannan mannohydrolase，EC 3.2.1.78）是β-1，4甘露聚糖甘露糖苷水解酶的簡稱，屬于半纖維素酶類，廣泛應用于食品、飼料、醫(yī)藥、紡織印染等方面[1]，在飼用酶制劑應用方面尤其重要[2]，添加β-甘露聚糖酶可以降解飼料中含有的β-甘露聚糖，有助于消除甘露聚糖對機體胰島素分泌和胰島素樣生長因子（IGF）生成的抑制作用，提高葡萄糖吸收速率，促進碳水化合物代謝過程，提高日糧能量利用率，是一種良好的飼料添加劑，也是抗生素的理想代替品[3]。

畢赤酵母（Pichia pastoris）表達系統(tǒng)既具有原核表達系統(tǒng)易于培養(yǎng)、繁殖快速、表達量高的優(yōu)點，又具有真核表達系統(tǒng)外源蛋白翻譯后再加工修飾等特點，目前已有超過500種外源蛋白在畢赤酵母中獲得成功表達。山東省微生物重點實驗室成功構建一株表達枯草芽孢桿菌β-甘露聚糖酶基因畢赤酵母工程菌，在前期工作的基礎上，本試驗通過優(yōu)化畢赤酵母工程發(fā)酵最適pH、溫度、碳源濃度、接種量等基礎條件，以及選取在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中的重要因素甲醇補料方式、甲醇濃度、菌體濃度、DO值等，進行畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達β-甘露聚糖酶的工藝優(yōu)化，獲得較為成熟的工藝，使酶活力達到工業(yè)化生產(chǎn)要求。

1 ?材料與方法

1.1 ?菌種

β-甘露聚糖酶畢赤酵母工程菌：山東省微生物重點實驗室構建、保存[4]。

1.2 ?儀器設備

30 L發(fā)酵罐為上海國強生化裝備有限責任公司生產(chǎn)，配備溫度、溶氧、pH電極、壓縮空氣、氨氣、冷卻水以及蒸汽系統(tǒng)。

1.3 ?培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基（YPD）：20 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物。

發(fā)酵基礎培養(yǎng)基：2.5%葡萄糖、5 g/L KH2PO4、3 g/L CaSO4、15 g/L K2SO4、15 g/L MgSO4、35 g/L NH4H2PO4、4.2 g/L KOH、12 g/L微量元素。endprint

分批補料培養(yǎng)基：50%甘油（W/V，g/mL）（含12 g/L微量元素溶液，g/mL）。

誘導劑：100%甲醇（含12 mL/L微量元素溶液）。

補料培養(yǎng)基：200 g NH4H2PO4、20 g CaSO4、100 g K2SO4、100 g MgSO4，定容至2 L。

微量元素溶液：參照Invitrogen表達手冊。

1.4 ?畢赤酵母表達β-甘露聚糖酶基礎條件優(yōu)化

1）在基礎培養(yǎng)基中分別添加1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%的葡萄糖或1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%的甘油作為碳源，單獨滅菌后混勻，調(diào)節(jié)pH 5.0，30 ℃、240 r/min培養(yǎng)24～30 h，初始碳源耗盡后，補充1 mL 50%甘油，甘油耗盡后饑餓培養(yǎng)0.5 h，每24 h補充100%甲醇0.4 mL，每24 h取發(fā)酵液測定酶活力，以確定最適碳源種類以及最適添加比例。

2）分別接種2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%YPD培養(yǎng)液（OD600 nm≈8.0）于發(fā)酵基礎培養(yǎng)基中，其他條件不變，測定酶活力確定最佳接種量。

3）誘導溫度梯度為26、28、30、32 ℃，其他條件不變，測定酶活力確定最佳接種量。

4）誘導pH梯度為4.5、5.0、5.5、6.0，其他條件不變，測定酶活力確定最佳接種量。

1.5 ?發(fā)酵罐高密度發(fā)酵β-甘露聚糖酶工藝優(yōu)化

1.5.1 ?發(fā)酵罐常規(guī)控制工藝 ?種子制備：YPD液體培養(yǎng)基于30 ℃、240 r/min培養(yǎng)至OD600 nm≈8.0時，按0.5%接入30 L種子罐中，30 ℃、400 r/min培養(yǎng)至OD600 nm≈8.0時，按8%接種量接入30 L發(fā)酵罐基礎培養(yǎng)基中。細胞增殖階段：pH 5.5、溫度30 ℃、罐壓0.1 MPa、通氣量1 m3/h、轉速400～600 r/min。誘導表達階段：pH 5.0、溫度28 ℃、罐壓0.12 MPa、通氣量2.0～ 4.5 m3/h、轉速600～800 r/min，采用連續(xù)補料方式添加甲醇，測定培養(yǎng)基中N、P含量剩余30%時，添加補料培養(yǎng)基。

1.5.2 ?不同誘導前菌體濃度對赤酵母產(chǎn)β-甘露聚糖酶酶活力的影響 ?基礎培養(yǎng)基中葡萄糖耗盡后，通過控制流加甘油時間提高菌體濃度，使誘導前菌體濃度分別達到80、100、140、180 g/L，其他條件不變，發(fā)酵180 h，測定酶活力確定最佳誘導前菌體濃度。

1.5.3 ?甲醇濃度對畢赤酵母產(chǎn)β-甘露聚糖酶酶活力的影響 ?初始添加甲醇速度1 mL/L·h，之后每小時增加1個單位，直至達到8 mL/L·h，之后控制甲醇流加速度，中后期使甲醇濃度分別達到為0.5、1.0 g/L，其他條件不變，發(fā)酵180 h，測定酶活力確定最佳甲醇濃度。

1.5.4 ?溶氧量（DO）對畢赤酵母產(chǎn)β-甘露聚糖酶酶活力的影響 ? 甲醇誘導階段，通過調(diào)節(jié)罐壓及通氣量，控制溶氧量在10%～20%、20%～30%、30%～40%，其他條件不變，發(fā)酵180 h，測定酶活力確定最佳溶氧量。

1.5.5 ?補料方式對畢赤酵母產(chǎn)β-甘露聚糖酶酶活力的影響 ?畢赤酵母工業(yè)化大規(guī)模發(fā)酵時，甲醇補料方式基本分為分批式補料、連續(xù)式補料等[5]，據(jù)此確定以下3種甲醇添加方案進行誘導表達：①分批式補料，每次補入1%甲醇，待甲醇消耗完后繼續(xù)補料;②分批-連續(xù)式補料，誘導初期加入0.5%甲醇，甲醇消耗完后，繼續(xù)補加0.5%甲醇，10 h后控制流速為8 ～12 mL/（L·h）;③連續(xù)式補料，誘導初期補料速度為1 mL/（L·h），每小時提升一個單位，10 h后控制流加速度為8～12 mL/（L·h）。

1.5.6 ?正交試驗 ?為進一步研究各因素間的相互關系，根據(jù)以上試驗結果，選取接種量、碳源濃度、溶氧量、誘導前濕重對發(fā)酵影響較大的因素，進行四因素三水平正交試驗，按正交L9（34）安排試驗（表1），各因素最佳值的確定以各水平平均值K最高為準。

1.5.7 ?批量發(fā)酵 ?在正交試驗優(yōu)化條件下，采用4套30 L上海國強發(fā)酵罐設備進行連續(xù)30批發(fā)酵，測定β-甘露聚糖酶酶活。

1.6 ?測定方法

1.6.1 ?β-甘露聚糖酶酶活測定方法 ?采用DNS法測定酶活，酶活單位定義為在37 ℃、pH 5.5的條件下，每分鐘從濃度3 mg/mL的甘露聚糖溶液降解釋放1 μmol還原糖所需的酶量為一個酶活單位。

1.6.2 ?發(fā)酵參數(shù)測定方法 ?采用高碘酸鈉氧化法測定甘油殘留濃度[6]，氣相色譜測定分析甲醇濃度[7]，甲醛滴定法測定氨基氮含量，鉬酸銨-米吐爾法測定磷含量，數(shù)據(jù)分析參照文獻[8]。

1.6.3 ?細胞質量濃度測定方法 ?取適量發(fā)酵液經(jīng)80 ℃烘干至恒重，測定細胞干質量，再除以所取發(fā)酵液體積即為細胞質量濃度[9]，根據(jù)測量數(shù)值繪制線性回歸曲線，細胞干重與OD600 nm的關系為DCW=0.226OD600 nm+0.017（R2=0.989 2）。

1.6.4 ?菌體濃度（WCW）測定方法 ?取發(fā)酵液，經(jīng)10 000 r/min離心5 min，去上清液，計算菌體濃度（g/L）。

1.6.5 ?發(fā)酵液中總蛋白與目的蛋白含量測定 ?采用考馬斯亮藍染色法測定發(fā)酵液中總蛋白含量[10]，使用BIO-PRINT凝膠成像與分析系統(tǒng)，根據(jù)發(fā)酵液中總蛋白含量計算目的蛋白含量。endprint

2 ?結果與分析

2.1 ?畢赤酵母產(chǎn)酶基礎條件分析

甘油濃度為1.5%與葡萄糖濃度為2.5%時，畢赤酵母產(chǎn)β-甘露聚糖酶酶活達到最高（圖1a），分別為1 032、998 U/mL，酶活力差距較小，鑒于工業(yè)級葡萄糖單價3 000～4 000元/t，甘油單價5 000～ ? 7 000元/t，在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中，宜選用葡萄糖作為初始碳源;不同pH對畢赤酵母產(chǎn)β-甘露聚糖酶酶活影響較大（圖1b），在pH 5.0時酶活最高，達到1 230 U/mL;接種量不僅影響菌體增殖速度，而且一定程度上影響了發(fā)酵培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分，當接種量為8%時，酶活達到最高1 100 U/mL（圖1c）;在不同溫度下進行誘導發(fā)酵，28 ℃時，β-甘露聚糖酶酶活最高，當溫度為32 ℃時，酶活力明顯降低（圖1d）。

2.2 ?發(fā)酵罐高密度發(fā)酵優(yōu)化

2.2.1 ?誘導前菌體濃度、溶氧量對β-甘露聚糖酶酶活的影響 ?提高菌體濃度是提高外源蛋白表達量的有效手段，但通過試驗驗證（圖2a），當誘導前菌體濃度為140 g/L發(fā)酵144 h時，β-甘露聚糖酶酶活最高，達到29 500 U/mL，過高的誘導前菌體濃度一定程度上抑制了酶蛋白的高效表達;通過測定不同溶氧條件下酶活（圖2b），發(fā)現(xiàn)當發(fā)酵罐通氣量控制在20%～30%、發(fā)酵144 h時，β-甘露聚糖酶表達量最高，達到29 000 U/mL。

2.2.2 ?甲醇補料方式對β-甘露聚糖酶酶活的影響 ?結果表明（圖3），采用連續(xù)補料的方式可以使畢赤酵母更好地適應甲醇，延長最佳表達周期，最高酶活達到29 000 U/mL，而采用分批補料的方式，受甲醇濃度過高影響，畢赤酵母前期未能適應碳源變化，導致48 h后外源蛋白停止表達，誘導期明顯縮短，采用分批-連續(xù)補料的方式，連續(xù)補料方式有助于酶蛋白表達，但前期變換碳源過渡不佳，導致發(fā)酵后期酶活不高，因此采用連續(xù)補料的方式進行畢赤酵母產(chǎn)β-甘露聚糖酶誘導表達。

2.2.3 ?發(fā)酵罐中不同甲醇濃度對β-甘露聚糖酶酶活的影響 ?21 h進入甲醇誘導期（圖4），甲醇濃度為約1.0 g/L時，菌體增殖速度與酶蛋白表達速度均明顯加快，但發(fā)酵后期高甲醇濃度下細胞大量衰亡，導致菌體濃度下降，同時菌體破裂造成酶蛋白降解[11]，發(fā)酵后期酶活損失嚴重;酶活方面，低甲醇濃度時在144 h酶活最高，達到29 600 U/mL，高甲醇濃度下在120 h達到最高酶活28 000 U/mL，雖然高甲醇組酶活較前者低，但其發(fā)酵周期縮短約24 h;無機鹽方面，隨著菌體不斷增殖，高甲醇濃度下氮、磷消耗同樣較快，當誘導階段進入80 h左右時，僅通過調(diào)節(jié)pH進入的氨氣不足以彌補氮消耗，因此在N、P剩余30%時添加補料培養(yǎng)基，后續(xù)60 h誘導階段氮、磷消耗仍然較快，表明之前補充氮源、磷源十分必要，以保持培養(yǎng)基中離子濃度穩(wěn)定性以及穩(wěn)定的滲透壓。甲醇濃度在0.5 g/L時酶蛋白表達量較高，因此，誘導時選擇添加0.5 g/L甲醇。

2.2.4 ?發(fā)酵條件正交優(yōu)化 ?正交試驗經(jīng)重復驗證后得到最佳發(fā)酵條件：接種量為10%、碳源濃度為3.0%、DO控制在10%～20%、誘導前濕重為140 g/L（表2），按極值差R值大小決定因素的主次順序為：DO、碳源濃度、接種量、誘導前濕重。

2.2.5 ?最優(yōu)發(fā)酵工藝下參數(shù)分析 ?表3為正交試驗最優(yōu)發(fā)酵工藝下畢赤酵母產(chǎn)β-甘露聚糖酶發(fā)酵參數(shù)，21 h開始甲醇誘導，150 h酶活達到最高29 600 U/mL，細胞干重、目的蛋白含量、比酶活分別為127.3 g/L、5.32 g/L、2 740.74 U/mg，目的蛋白生成比速率（qp）、細胞對甲醇得率（Yx /s）、目的蛋白對細胞得率（Yp /s）分別為0.201 mg/g·h、0.158 g/g、5.96 mg/g;比酶活隨誘導時間不斷升高，在酶蛋白高表達期達到最高值，150 h之后酶活力和比酶活等均呈下降趨勢，此時畢赤酵母不斷表達外源蛋白以及蛋白降解綜合作用的表觀結果，因此發(fā)酵應控制在150 h。

2.2.6 ?搖瓶發(fā)酵與發(fā)酵罐高密度發(fā)酵蛋白電泳 ?結果（圖5）表明，在約37 kDa處有明顯的目的條帶，搖瓶發(fā)酵時，發(fā)酵上清液中雜蛋白很少，但在發(fā)酵罐高密度發(fā)酵過程中，隨著酶蛋白表達量的不斷提高，雜蛋白含量相對增加，147 h前，蛋白含量隨時間延長不斷增加，之后由于細胞衰亡，上清液中的酶蛋白被部分降解，在227 h時，蛋白含量已經(jīng)降解50%以上。

2.2.7 ?批量發(fā)酵結果 ?在正交試驗最優(yōu)工藝條件下，采用4套30 L上海國強發(fā)酵罐設備進行連續(xù)30批發(fā)酵，得到酵母細胞干重均達120～160 g/L，達到高密度發(fā)酵目的，并且β-甘露聚糖酶蛋白的表達量達到5.1 g/L，酶活力達到29 600 U/mL。

3 ?小結與討論

溫度不但影響畢赤酵母發(fā)酵液溶氧量、基質的分解吸收速率，還會影響發(fā)酵產(chǎn)物的活性及生物合成方向[12]，是影響細胞生長和目的蛋白產(chǎn)率及穩(wěn)定性的一個重要因素，最佳誘導溫度是各種因素綜合表現(xiàn)的結果[13]。不同外源基因對溫度要求不同，在本試驗中，溫度升高有利于提高酶蛋白表達速率，誘導溫度為28 ℃時，酶活最高，達到1 150 U/mL，溫度繼續(xù)升高時，酶活單位時間增加較快，但發(fā)酵后期酶活衰減嚴重，這是因為溫度升高，表達速度過快不利于外源蛋白的正確折疊和有效地向胞外分泌[14]，當溫度為32 ℃時，外源蛋白表達嚴重受阻。

在畢赤酵母高密度發(fā)酵過程中，溶氧作為重要參數(shù)，不同溶氧水平，甲醇代謝速率和代謝產(chǎn)物相差較大[15]。低溶氧水平下，酵母因溶氧不足，呼吸向無氧代謝途徑漂移[16，17]，導致甲醇利用減慢，最終生成乙醇、乙酸等副產(chǎn)物，進一步抑制酵母生長，同時也抑制醇氧化酶AOX活性，降低外源蛋白表達量，而溶氧過高時，會促進胞內(nèi)活性氧（ROS）的積累，對細胞造成損傷，影響表達系統(tǒng)的穩(wěn)定性[18]，合適的溶氧值有助于外源蛋白的高效表達[19]。本試驗發(fā)現(xiàn)較低的溶氧更利于β-甘露聚糖酶的表達，這與發(fā)酵工藝中較低的甲醇濃度有關，作為畢赤酵母Mut+型，對甲醇需求較大，且易受甲醇濃度影響[20]，在誘導期，甲醇作為惟一碳源，被酵母增殖與目的蛋白誘導表達競爭消耗，此時過低的甲醇濃度會導致誘導不足而降低酶蛋白表達量，濃度過高又抑制菌體增殖，導致發(fā)酵失敗[21]。王帥坤等[22]在較高的甲醇以及較高的溶氧量下獲得最優(yōu)發(fā)酵條件，但本試驗甲醇濃度在0.5 g/L時酶蛋白表達量較高，此時只需10%～20%較低的溶氧量就可滿足酶蛋白的高效表達，進一步降低了供氧設備成本。endprint

高密度發(fā)酵時基因工程是提高外源蛋白表達量的重要策略之一。目前，一般認為酵母細胞密度為100～200 g/L（DCW）即為高密度發(fā)酵，本試驗中采用4套30 L上海國強發(fā)酵罐設備進行連續(xù)30批發(fā)酵，細胞干重均達120～160 g/L，達到高密度發(fā)酵目的，并且β-甘露聚糖酶蛋白的表達量達到5.1 g/L，酶活達到29 600 U/mL，遠高于目前相關報道，如Chen等[23]將硫色曲霉的甘露聚糖酶基因序列優(yōu)化在畢赤酵母中進行分泌表達，發(fā)酵酶活為1 100 U/mL，喬宇等[24]克隆一株枯草芽孢桿菌中的甘露聚糖酶基因至畢赤酵母中，在5 L發(fā)酵罐中進行高密度發(fā)酵，酶活為1 102 U/mL，馬威等[25]將枯草芽孢桿菌中的甘露聚糖酶基因克隆到畢赤酵母中，10 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵活為2 100 U/mL，張娟等[26]克隆黑曲霉中甘露聚糖酶基因到畢赤酵母中，進行5 L液體發(fā)酵，酶活為11 785 U/mL。

本試驗獲得畢赤酵母產(chǎn)β-甘露聚糖酶最佳發(fā)酵工藝，初始葡萄糖質量濃度為30 g/L，誘導前菌體濕重140 g/L（DCW約27 g/L），誘導溫度為28 ℃，pH 5.0，誘導期溶氧量控制在10%～20%，甲醇流加方式采用前10 h為適應期，后續(xù)采用溶氧恒定法，控制甲醇流速在8～12 mL/（L·h）。最終細胞干重為135 g/L，胞外總蛋白含量達到10.9 g/L（目的蛋白5.1 g/L），酶活最高為29 600 U/mL，是搖瓶培養(yǎng)最高酶活力的24倍，通過本試驗優(yōu)化產(chǎn)酶條件及高密度發(fā)酵工藝研究，使得畢赤酵母表達β-甘露聚糖酶工程菌酶活力得到極大提高，已滿足工業(yè)化生產(chǎn)要求。

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