沙格列汀抑制NF-κB信號通路下調LPS誘導的人腎小管上皮HK-2細胞MCP-1的表達*

李清福1夏纓2李曉艷1何彥蓉1張維3李露4

(成都軍區(qū)機關醫(yī)院 1.內(nèi)分泌科; 2.第二門診部, 四川 成都 610000;3.成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院， 四川 成都 610500;

4.四川大學華西醫(yī)院，四川 成都 610041)

【摘要】目的探討二肽基肽酶4(DPP-4)競爭性抑制劑沙格列汀(saxagliptin)對脂多糖(LPS)誘導狀態(tài)下人腎小管上皮HK-2細胞MCP-1表達的調節(jié)作用及相關的分子機制。方法將人腎小管上皮細胞HK-2細胞分為3組，分別為對照組(Control組)、LPS+沙格列汀 (LPS+SAX組)和LPS組。在干預12小時后使用RT-PCR法和western blot法對HK-2細胞MCP-1 mRNA和蛋白的表達水平進行檢測；并使用western blot法對HK-2細胞NF-κB p65活化水平(phospho-NF-κB p65/total NF-κB p65比值)進行分析。結果與Control組相比較，在LPS干預12小時后 HK-2細胞MCP-1 mRNA和蛋白的表達水平以及phospho-NF-κB p65/total NF-κB p65比值均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；但LPS組較LPS+SAX組MCP-1 mRNA和蛋白的表達的升高以及phospho-NF-κB p65/total NF-κB p65比值的增加更加顯著，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論DPP-4抑制劑沙格列汀可以通過抑制NF-κB的磷酸化下調LPS誘導的人腎小管上皮HK-2細胞MCP-1合成和釋放并對其產(chǎn)生保護作用。

【關鍵詞】沙格列??； HK-2細胞； 單核細胞趨化蛋白-1 (MCP-1)； 核轉錄因子-κB (NF-κB)

【中圖分類號】R 446

【文獻標志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2015.10.005

Abstract【】ObjectiveTo explore whether saxagliptin could down-regulate LPS-induced MCP-1 expression in human proximal tubular epithelial cells, and its potential molecular mechanism. MethodsHuman proximal tubular epithelial cells (HK-2 cells) were divided into 3 groups, Control group, LPS+saxagliptin group (LPS+SAX group) and LPS group. RT-PCR was used to measure the mRNA expression of MCP-1. The protein expression of MCP-1 and the phosphorylation level of NF-κB p65 were analyzed by western blot. ResultsAfter 12 hours LPS stimulation, the mRNA and protein expression of MCP-1 were remarkably up-regulated, and the ratio of phospho-NF-κB p65/total NF-κB p65 were sharply raised. Then, LPS-induced the up-regulation of MCP-1 and the raised ratio of phospho-NF-κB p65/total NF-κB p65 were all noticeably inhibited by saxagliptin in HK-2 cells. ConclusionSaxagliptin down-regulates LPS-induced MCP-1 expression possibly via inhibition of NF-κB in human proximal tubular epithelial cells (HK-2 cells).

基金項目：四川省教育廳科研課題(11ZB172)。

通訊作者：李清福，E-mail:liqingfucdjq2010@163.com

收稿日期：( 2014-10-10； 編輯： 陳舟貴)

Saxagliptin down-regulates LPS-induced MCP-1 expression via inactivation of NF-κB in human proximal tubular epithelial cellsHE Rong1, LI Qingfu1, XIA Ying2,etal

(1.DepartmentofEndocrinology,TheAffiliatedHospitalofChengduMilitaryRegion,Chengdu610000,China;

2.DepartmentofTheSecondOutpatient,TheAffiliatedHospitalofChengduMilitaryRegion,Chengdu610500,China;

3.TheFirstAffiliatedHospitalofChengduMedicalCollage,Chengdu610000,China;

4.WestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041,China)

【Key words】Saxagliptin; HK-2 cells; Monocyte chemotactic protein-1; NF-κB

胰高糖素樣肽-1 (glucagon-like peptide-1, GLP-1)屬于腸肽類激素(incretin)，主要由腸道內(nèi)L細胞合成和分泌，具有包括調節(jié)胰島素分泌、糖代謝和脂代謝等多種生理效應[1～4]。進一步的研究發(fā)現(xiàn)GLP-1還具有調節(jié)能量代謝以外的包括抑制炎癥反應、抑制氧化應激、抗器官纖維化以及調節(jié)細胞凋亡等多種生物學效應[2～9]。同時發(fā)現(xiàn)二肽基肽酶4 (dipeptidyl peptidase, DPP-4)是GLP-1代謝最主要的關鍵酶，抑制DPP-4可以有效的減少和延遲GLP-1的分解和代謝[2～9]。DPP-4競爭性抑制劑和GLP-1擬似物已廣泛應用于Ⅱ型糖尿病的臨床治療[10]。本研究主要觀察DPP-4競爭性抑制劑沙格列汀(saxagliptin)對脂多糖(LPS)誘導損傷狀態(tài)下的人腎小管上皮HK-2細胞的保護作用及相關的分子機制。

1材料和方法

1.1主要試劑和材料人腎小管上皮HK-2細胞購買于中國科學院上海細胞庫；PCR試劑盒購自TaKaRa公司；沙格列汀購買于上海施貴寶公司；鼠抗人β-actin抗體、鼠抗人MCP-1抗體、鼠抗人NF-κB p65抗體和鼠抗人phospho-NF-κB p65抗體購于美國Santa Cruz公司；DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，小牛血清(杭州四季清)，超純水。其余試劑均為分析純。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)人腎小管上皮HK-2細胞常規(guī)接種在含10%胎牛血清和青霉素、100 g/L 鏈霉素的DEME培養(yǎng)液中，置于37℃、95%空氣、5 % CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。每48 h換液、傳代2次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。HK-2細胞分為對照組(Control組)、LPS+沙格列汀 (LPS+SAX組)和LPS組。其中對照組細胞加入PBS；LPS組和LPS+沙格列汀組加入LPS (1 μg/ml)；LPS+沙格列汀加入終濃度為0.5 μM的沙格列汀溶液進行干預。

1.2.2細胞MCP-1 mRNA表達檢測干預12h后，按照RT-PCR試劑盒說明書提取細胞總RNA。引物：MCP-1正義5′-GCTCGCTCAGCCAGATGCAA T-3′，反義5′-TGGGTTGTGGAGTGAGTGTTC-3′和β-actin正義：5′-CGAGCGGGCTACAGCTTC-3′，反義：5′-GTCACGCACGATTCCCTCT-3′。按照試劑盒說明書介紹進行反轉錄和擴增實驗。應用凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad)攝影，Quantity One軟件對目的條帶進行掃描分析。用與β-actin PCR產(chǎn)物條帶灰度比值作為MCP-1 mRNA的相對表達量。

1.2.3Western blot法檢測細胞中MCP-1蛋白表達和NF-κB p65活化水平干預12h后，按操作要求，首先提取細胞總蛋白，并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1 h，分別加入鼠抗人單克隆抗體MCP-1 (1∶800)、phospho-NF-κB p65 (1∶1000)、 NF-κB p65 (1∶1000)和β-actin (1∶2000)，4℃孵育過夜，洗膜后加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶2000)，用ECL進行顯色，用凝膠成像分析系統(tǒng)進行掃描。

1.3統(tǒng)計學分析采用SPSS 17.0進行單因素方差分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示。兩樣本均數(shù)多重比較采用LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1MCP-1 mRNA和蛋白的表達在干預12h后，對人腎小管上皮HK-2細胞MCP-1 mRNA和蛋白的表達水平使用RT-PCR法和western blot法進行分析。發(fā)現(xiàn)與Control組相比較，HK-2細胞在LPS干預后MCP-1 mRNA和蛋白的表達水平顯著增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。同時發(fā)現(xiàn)LPS組細胞MCP-1 mRNA和蛋白表達水平較LPS+SAX組細胞增加更加顯著，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1和表1。

圖1HK-2細胞MCP-1表達的RT-PCR和western blot結果

Figure 1The RT-PCR and Western blot results of MCP-1 in HK-2 cells

Table 1The mRNA and protein expression of MCP-1, and the activation of NF-κB p65 in HK-2 cells(±s)

組別MCP-1mRNAMCP-1蛋白phospho-NF-κBp65/totalNF-κBp65Control組0.17±0.30.15±0.040.19±0.05LPS+SAX組0.63±0.15①②0.54±0.09①②0.58±0.13①②LPS組0.92±0.04①0.96±0.08①0.95±0.12①

注：與Control組相比較①P<0.05；與LPS組相比較②P<0.05。

2.2NF-κB p65活化水平在干預12h后，對人腎小管上皮HK-2細胞NF-κB p65活化水平即NF-κB p65磷酸化水平(phospho-NF-κB p65/total NF-κB p65比值)使用western blot進行分析。發(fā)現(xiàn)與Control組比較，HK-2細胞在LPS干預后NF-κB p65磷酸化水平顯著上調，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。同時發(fā)現(xiàn)LPS組細胞NF-κB p65磷酸化水平較LPS+SAX組細胞上調更加顯著，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2和表1。

圖2HK-2細胞NF-κB p65活化的western blot結果

Figure 2The Western blot results of the activation of NF-κB p65 in HK-2

3討論

研究發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細胞損傷及損傷后相關的腎間質纖維化在急性腎損傷(acute kidney injury, AKI)、糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)及多種原發(fā)性腎小球腎炎中扮演著重要的角色，保護和減輕腎小管上皮細胞損傷是治療急性腎損傷和糖尿病腎病等腎臟疾病的關鍵和重點[11～16]。

胰高糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)屬于腸肽類激素(incretin)，主要由廣泛分布于小腸和大腸的L細胞合成和分泌[1～9]。研究發(fā)現(xiàn)GLP-1的分泌主要呈血糖濃度依賴性控制，即當血糖水平上升時GLP-1釋放增多，血糖水平下降時釋放減少。二肽基肽酶4 (dipeptidyl peptidase, DPP-4)是GLP-1代謝的關鍵酶，抑制DPP-4可以有效的減少和延遲GLP-1的分解和代謝[1～9]。沙格列汀(saxagliptin)作為DPP-4抑制劑已廣泛應用于Ⅱ型糖尿病的臨床治療[10]。GLP-1主要通過與GLP-1受體(GLP-1R)結合產(chǎn)生相應的生物學效應，實驗發(fā)現(xiàn)胰腺β細胞表面存在大量GLP-1R，當GLP-1與GLP-1R結合后可通過PKA等信號通路誘導胰島素的合成和分泌增加，維持體內(nèi)血糖水平的相對恒定[1～9]。同時近期的研究發(fā)現(xiàn)，GLP-1R還廣泛表達于胰腺組織以外的多種組織細胞[17～19]。Fujita H等使用基因敲除小鼠證實小鼠腎小球血管內(nèi)皮細胞表面存在GLP-1R的表達[17]。Thomson SC等人的研究發(fā)現(xiàn)大鼠近曲小管細胞存在GLP-1R的表達[18]。Romaní-Pérez M等證實肺組織中II肺泡上皮細胞和氣道上皮細胞表明存在GLP-1R的表達[19]。進一步的研究發(fā)現(xiàn)GLP-1還具有獨立于降糖等調節(jié)能量代謝以外的包括抑制炎癥反應、抑制氧化應激、抗器官纖維化、調節(jié)細胞凋亡和誘導腫瘤細胞自噬等多種藥理和生物學效應[9, 20]。Viby NE等的研究發(fā)現(xiàn)GLP-1可以有效抑制COPD小鼠的肺部炎癥水平并改善其肺功能和死亡率。Gou S等人的研究發(fā)現(xiàn)GLP-1可以有效的抑制博萊霉素誘導的小鼠肺間質纖維化[9]。Yi B等的實驗發(fā)現(xiàn)GLP-1R激動劑exendin-4可以通過抑制晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products, RAGE)的表達減輕高脂血癥有誘導的心肌細胞凋亡[21]。單核細胞趨化蛋白-1 (MCP-1)屬于CC類趨化因子家族成員，多種細胞如巨噬細胞、肺上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞和腎小管上皮細胞可在炎癥、氧化應激和損傷狀態(tài)下大量表達[22, 23]。MCP-1可以通過與對應的趨化因子受體，包括CCR2、CCR4和CCR10結合，進一步誘導單核細胞和T淋巴細胞的激活和聚集，同時進一步刺激相應細胞合成和釋放炎癥介質和粘附分子，對炎癥反應產(chǎn)生放大作用[22, 23]。同時研究發(fā)現(xiàn)MCP-1的表達水平與糖尿病腎病和急性腎損傷等狀態(tài)下腎組織炎癥程度密切相關[22, 23]。目前部分研究認為血和/或尿液中MCP-1水平可用于DN和AKI嚴重程度的判定以及治療效果的檢測[22, 23]。同時張繼強等人的研究證實下調MCP-1的表達可以有效抑制和延緩DN大鼠腎臟的炎癥反應和病理改變[22]。Hu F等人的研究認為在DN和AKI的炎癥狀態(tài)下MCP-1是導致腎小管間質纖維的重要因素，下調MCP-1的表達可以有效抑制LPS誘導的腎小管上皮細胞損傷和小管間質纖維化的發(fā)生[23]。本實驗中我們使用LPS誘導人腎小管上皮HK-2細胞的炎癥反應和損傷。并發(fā)現(xiàn)在給予LPS干預12小時后HK-2細胞MCP-1 mRNA和蛋白表達水平明顯增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。同時發(fā)現(xiàn)給予沙格列汀干預的HK-2細胞較未干預細胞MCP-1 mRNA和蛋白的表達水平更低，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。該結果表明沙格列汀可以有效抑制LPS誘導的人腎小管上皮HK-2細胞MCP-1的合成和表達。

近期研究表明GLP-1對炎癥的調控作用與調節(jié)NF-κB的活化密切相關[9]。Gou S等人的研究發(fā)現(xiàn)GLP-1可以通過抑制NF-κB p65的磷酸化抑制博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化[9]。同時大量研究證實NF-κB信號通路對于MCP-1的表達具有關鍵調控作用[24]。本實驗中我們使用western blot法對NF-κB p65的磷酸化進行分析后發(fā)現(xiàn)在給予LPS干預12小時后HK-2細胞NF-κB p65活化水平明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。且LPS組細胞NF-κB p65磷酸化水平較LPS+SAX組細胞上調更加顯著，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。該結果表明在人腎小管上皮HK-2細胞中沙格列汀對LPS誘導的NF-κB p65磷酸化有顯著的抑制作用。

4結論

本實驗結果表明，DPP-4抑制劑沙格列汀可通過抑制NF-κB磷酸化抑制LPS誘導的人腎小管上皮HK-2細胞MCP-1合成和釋放并對其產(chǎn)生保護作用。

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本刊對來稿中法定計量單位的書寫要求

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(本刊編輯部)