辛偉翔， 潘　淼， 趙圣印

(東華大學(xué) 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620)

4-羥基-2(1H)-吡啶酮-3-甲酰胺類冬青生菌素類似物的合成與生物活性

辛偉翔， 潘淼， 趙圣印*

(東華大學(xué) 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620)

摘要：以反式-4-羥基肉桂酸為起始原料，經(jīng)乙?；Ⅴ；B氮、curtius重排、加成和環(huán)合等6步反應(yīng)合成了4-羥基-2(1H)-吡啶酮-3-甲酰胺類冬青生菌素類似物，總收率17%.隨后用濾紙片擴(kuò)散法對該化合物的抑菌性能進(jìn)行了初步研究.實(shí)驗(yàn)表明，該化合物對于白色念珠菌具有較好的抑制作用，對于酵母菌抑制作用較弱，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌基本無抑制作用.

關(guān)鍵詞：4-羥基-2(1H)-吡啶酮-3-甲酰胺；冬青生菌素類似物；合成；抗真菌

真菌感染可導(dǎo)致各種人類疾病，因此很多藥物被開發(fā)出來用于對抗真菌感染，例如唑類抗真菌藥如氟康唑等、大環(huán)多烯類藥物如兩性霉素B等，但是這些藥物大都存在副作用大以及耐藥性的問題，所以研究開發(fā)新型的抗真菌藥物具有重要意義.

1971年日本學(xué)者HAYAKAWA等[1]從山毛櫸樹枯萎的葉片中分離出來的柱枝雙孢菌屬冬青生菌MFC-870中提取分離得到冬青生菌素H (Ilicicolin H)，實(shí)驗(yàn)表明該化合物具有抗炭疽桿菌的能力(6 mg/L).該化合物的結(jié)構(gòu)在1976年通過化學(xué)降解的方法得到了闡明[2].1985年WILLIAM等人[3]采用全合成的方法進(jìn)一步證實(shí)了其結(jié)構(gòu).Ilicicolin H是一種潛在的廣譜抗真菌藥物，其作用機(jī)理是通過選擇性的抑制真菌線粒體中的氧化還原酶細(xì)胞色素bc1的活性來起到抗菌作用的[4].但是由于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜以及和血漿蛋白鍵合作用強(qiáng)等因素致使其應(yīng)用受到限制.因此，對冬青生菌素H進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾及簡化成為目前的研究熱點(diǎn).2012年，SINGH等人[5]通過構(gòu)建模型的方法研究了Ilicicolin H的分子結(jié)構(gòu)與藥物活性的關(guān)系，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，β-羰基的結(jié)構(gòu)對于該化合物的抗菌活性有著重要的作用.2013年，SINGH等人[6]進(jìn)一步對Ilicicolin H的4′位羥基、4位的羥基、2位的羰基、7位的羰基，12位的甲基以及雙鍵進(jìn)行了化學(xué)修飾，并對這些化合物進(jìn)行了抗真菌活性的比較.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對Ilicicolin H的C-4′和C-19位的修飾可以減少其與血漿蛋白的鍵合作用，這為以后的修飾改造提供了寶貴的信息.本文作者以反式對羥基肉桂酸為原料通過乙?；?、取代、Curtius重排、加成、環(huán)化和去保護(hù)等6步反應(yīng)，合成了一個新型冬青生菌素H類似物4-羥基-2(1H)-吡啶酮-3-甲酰胺化合物，隨后又利用濾紙片擴(kuò)散法進(jìn)行了抗真菌和抗菌活性測試.

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1　儀器與試劑

Thermo Scientific Nicolet iS5型傅立葉變換紅外光譜儀，美國熱電公司；Bruker AV-400型核磁共振儀，布魯克公司；LCMS-8030型液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀，日本島津公司；全自動高壓蒸汽滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；全自動菌落計數(shù)儀，杭州迅數(shù)科技有限公司；雷磁型數(shù)顯pH計，上海精密科學(xué)儀器有限公司.

對羥基肉桂酸、疊氮磷酸二苯酯(DPPA)、一縮二乙二醇二甲醚、丙二酸二乙酯、葡萄糖、胰蛋白胨、瓊脂粉、牛肉膏、氯化鈉、甲苯、碳酸鉀和氯化銨均為市售分析純試劑.

1.2　實(shí)驗(yàn)用菌

白色念珠菌ATCC10231、金黃色葡萄球菌ATCC6538、大腸桿菌ATCC11229和黏質(zhì)紅酵母均從ATCC公司購得.

1.3　試驗(yàn)用培養(yǎng)基

1.3.1真菌培養(yǎng)基

葡萄糖40 g，胰蛋白胨10 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水(最終定容至1 000 mL)，用稀HCl調(diào)整pH=5.6±0.2，于121 ℃滅菌20 min.

1.3.2細(xì)菌培養(yǎng)基

牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，氯化鈉 5 g，瓊脂粉 20 g，蒸餾水(定容至1 000 mL)，用稀NaOH溶液調(diào)整pH為7.4~7.6，于121 ℃滅菌20 min.

1.4　目標(biāo)化合物的合成

本路線以反式對羥基肉桂酸為原料，經(jīng)乙?；⑷〈?、Curtius重排、加成、環(huán)化和去保護(hù)等6步反應(yīng)合成了目標(biāo)產(chǎn)物，其合成路線見圖1.

圖1　化合物的合成路線Fig.1　The synthetic route of compound

1.4.1化合物2的合成

將5.0 g (30.5 mmol)對羥基肉桂酸(1)放入250 mL的梨形燒瓶中，加入0.2 g (1.6 mmol) 4-二甲氨基吡啶 (DMAP)，用15 mL吡啶溶解，再加入醋酸酐10 mL (106.0 mmol)，常溫磁力攪拌，TLC監(jiān)控反應(yīng)，2 h后反應(yīng)結(jié)束.用稀鹽酸將溶液pH調(diào)至小于2，加入乙酸乙酯將析出固體溶解，萃取.有機(jī)層再用飽和食鹽水洗一次.有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，旋干.固體用無水乙醇重結(jié)晶，得到6.1 g白色晶體，產(chǎn)率97%.mp:204~205 ℃ (lit[8]:205~206 ℃)；IR(cm-1,KBr):3 356,2 978,2 850,1 735,1 610,1 520,1 450.

1.4.2化合物3的合成

將3 g (14.6 mmol) 對乙酰氧基肉桂酸(2)用30 mL甲苯溶解，置于冰浴中，將4.8 g (17.5 mmol)疊氮磷酸二苯酯和1.8 g (17.5 mmol)三乙胺混合物滴入反應(yīng)液中，室溫攪拌，TLC監(jiān)控反應(yīng)，5 h后反應(yīng)結(jié)束.加入30 mL乙酸乙酯，分別用飽和碳酸鈉溶液、飽和氯化鈉溶液各洗滌一次，有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，蒸去溶劑得淺黃色固體3.1 g，產(chǎn)率92.0%.IR(cm-1,KBr):2 972,2 352,2 171,1 732,1 677,1 593,1 479,1 291,1 091.未經(jīng)純化直接用于下步反應(yīng).

1.4.3化合物4的合成

將3.0 g (12.9 mmol) 對乙酰氧基肉桂酰疊氮(3)用30 mL無水甲苯溶解，升溫至80 ℃，TLC監(jiān)控反應(yīng)，7 h后原料點(diǎn)基本消失.由于產(chǎn)物對乙酰氧基肉桂異腈酸酯不穩(wěn)定，所以未經(jīng)提純直接用于下步反應(yīng).

1.4.4化合物5的合成

取2.5 g (15.6 mmol) 丙二酸二乙酯和15 mL無水甲苯，冰浴冷卻，緩慢加入0.73 g (18.2 mmol) NaH (60%)，加畢攪拌10 min，將所得的反應(yīng)液加入到置于冰浴中的含有對乙酰氧基肉桂異氰酸酯(4)的反應(yīng)液里；常溫反應(yīng)過夜，TLC監(jiān)控反應(yīng)，完畢用飽和氯化銨溶液淬滅反應(yīng)，加入30 mL乙酸乙酯萃取，隨后用飽和碳酸鈉溶液洗滌3次、飽和氯化鈉溶液洗滌1次，有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，將有機(jī)層旋干，得到棕褐色油狀液體.柱層析分離，展開劑為乙酸乙酯與石油醚混合溶劑(V乙酸乙酯∶V石油醚= 1∶4)，得到白色固體3.1 g，產(chǎn)率63.8%.mp:121~123 ℃；IR(cm-1,KBr):3 310,1 731,1 671,1 511,1 380,1 251,1 172,1 093;1H NMR (400 MHz,CDCl3)δ：1.34 (t,J= 7.1 Hz,6H,-CH3),2.31 (s,3H,COCH3),4.32 (q,J= 7.1 Hz,4H,-OCH2),4.43 (s,1H,CH),7.04 (d,J= 8.4 Hz,2H,Ar-H),7.28 (s,1H,=CH),7.35 (d,J= 8.4 Hz,2H,Ar-H),7.46 (dd,J= 14.6,10.7 Hz,1H,=CH-NH),9.25 (d,J= 10.5 Hz,1H,NH).

1.4.5化合物6的合成

將2.0 g (5.5 mmol) N-(4-乙酰氧基苯乙烯基)胺甲酰丙二酸二乙酯(5)和30 mL的一縮二乙二醇二甲醚混合，加熱回流，TLC監(jiān)控反應(yīng)，2 h后原料點(diǎn)基本消失，停止反應(yīng).將溶劑減壓蒸出，得到褐色油狀液體.柱層析分離，展開劑為乙醇與二氯甲烷的混合溶劑(V乙醇∶V二氯甲烷= 1∶50)，得到白色固體0.53 g，產(chǎn)率43.0%.mp:297~299 ℃.IR(cm-1,KBr):3 427,2 971,2 851,1 733,1 672,1 641,1 551,1 507,1 450,1 255,1 171,1 091;1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ:2.27 (s,3H,COCH3),2.30 (s,3H,COCH3),6.55 (d,J= 14.7 Hz,1H,=CH),7.08 (d,J= 8.5 Hz,2H,Ar-H),7.18 (d,J= 8.5 Hz,2H,Ar-H),7.50 (d,J= 8.5 Hz,2H,Ar-H),7.55 (d,J= 8.6 Hz,2H,Ar-H),7.64 ~ 7.57 (m,1H,=CHNH),7.75 (s,1H,-NH),12.33 (s,1H,-NH),12.39 (d,J= 10.6 Hz,1H,-NH),15.98 (s,1H,-OH).13C NMR (101 MHz,DMSO-d6)δ:21.33,97.72,113.47,115.29,121.49,122.13,122.56,127.07,130.55,130.72,134.02,138.86,149.75,150.30,162.90,168.53,169.70,173.39.ESI-HRMS Calcd.For C24H20N2O7:448.127 1,Found:448.127 5.

1.4.6化合物7的合成

將0.5 g(1.1 mmol)化合物6、0.31 g(2.2mmol) K2CO3和20 mL甲醇混合，室溫攪拌2 h，反應(yīng)完畢減壓旋出溶劑，加入15 mL水，用稀鹽酸調(diào)pH至5~6，再加入30 mL乙酸乙酯萃取，旋出溶劑，得白色產(chǎn)物0.38 g，產(chǎn)率95%.mp:275~277 ℃；IR(cm-1,KBr):3 310,1 671,1 511,1 251,1 172,1 093.1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ:6.41 (d,J= 14.7 Hz,1H,=CH),6.73 (d,J= 8.6 Hz,2H,Ar-H),6.80 (d,J= 8.4 Hz,2H,Ar-H),7.32 ~7.25 (m,4H,Ar-H),7.45 (dd,J= 14.7,4.6 Hz,1H,=CHNH),7.58 (d,J= 4.6 Hz,1H,-NH),9.55 (s,1H,Ar-OH),9.50 (s,1H,Ar-OH),12.18 (s,1H,-NH),12.34 (d,J= 10.5 Hz,1H,=CHNH),16.00 (s,1H,-OH).13C NMR (101 MHz,DMSO-d6)δ:97.69,114.45,115.46,115.49,116.06,116.35,118.68,123.73,127.08,127.45,130.58,157.34,162.94,168.15,173.48,173.78.ESI-MS (m/z):365(M+H)+.

1.5　抑菌測試

1.5.1梯度濃度的化合物溶液的配制

取目標(biāo)化合物0.1 g溶于10 mL的1% DMSO(水溶液)中，得到10 g/L的化合物原液.從原液中取1 mL加入9 mL 1% DMSO制得1 g/L的溶液.同樣操作制得0.1、0.05和0.01 g/L的溶液，備用.

1.5.2濾紙片擴(kuò)散法抑菌測試[7-8]

用壓片機(jī)壓取一批直徑6 mm的濾紙片，滅菌，備用.取4種活化菌株，用PBS緩沖溶液稀釋菌液濃度至1×106~1×107CFU/mL.取0.1 mL菌液均勻涂布在對應(yīng)的培養(yǎng)基上；將制備好的濾紙片泡在待測化合物溶液中1 min，取出貼在培養(yǎng)基上.另有1% DMSO空白對照.重復(fù)3組.將培養(yǎng)皿置于(37±0.2)℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18~24 h.于自動菌落計數(shù)器下觀察抑菌圈大小，抑菌圈>20 mm屬于強(qiáng)抑菌作用，10~20 mm屬于中等抑菌作用，<10 mm屬于弱抑菌作用[9].

1.5.3最低抑制濃度的測定[10]

將濾紙片泡在不同濃度的檢測溶液中1 min，取出貼在已經(jīng)均勻涂布了白色念球菌的培養(yǎng)基上，1% DMSO做空白對照，設(shè)3組平行實(shí)驗(yàn).將培養(yǎng)皿置于(37±0.2) ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18~24 h，并于自動菌落計數(shù)器下觀察抑菌圈大小.沒有抑菌作用的最低濃度即為最低抑菌溶度.

2結(jié)果與討論

2.1　合成方法

本路線以廉價易得的對羥基肉桂酸為原料，各步反應(yīng)操作簡單，條件溫和，產(chǎn)率高，具有較好的經(jīng)濟(jì)性和實(shí)用性.同時改進(jìn)了環(huán)合溶劑，用沸點(diǎn)相對較低的二乙二醇縮二甲醚替代報道的高沸點(diǎn)溶劑二苯醚[11],使后處理變得相對簡單.

2.2　目標(biāo)化合物7對不同菌株的抑菌效果

取10 g/L化合物7待測液進(jìn)行不同菌株抑菌效果實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后測量對各個菌株的抑菌圈大小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示.

表1　不同菌種的抑菌活性Table 1　Antimicrobial acvitity of different strains

由表1可知，該化合物對于白色念珠菌具有較強(qiáng)的抑制作用，對酵母菌的抑制作用中等偏弱，對于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌基本無抑制作用.說明該化合物對于真菌的抑制效果要好于對細(xì)菌的抑制效果.所以我們選取白色念珠菌進(jìn)行最低抑制濃度(MIC)的測定.

2.3　最低抑制濃度的測定[12]

取10、1、0.1、0.05和0.01 g/L 5組濃度溶液測試該化合物對白色念珠菌的最低抑菌溶度，于自動菌落計數(shù)器下觀察抑菌圈大小，結(jié)果如表2所示.

表2　濃度對抑菌性的影響Table 2　Effect of concentration on antimicrobial activity

“+”表示有抑菌效果，”-”表示無抑菌效果

由表2可知，當(dāng)溶度降至0.05 g/L以下時，抑菌效果基本消失，所以該測試條件下，化合物對于白色念珠菌的最低抑制濃度為0.05 g/L.

3結(jié)論

以反式對羥基肉桂酸為原料，經(jīng)6步反應(yīng)，以17%的總產(chǎn)率合成了目標(biāo)化合物7，該化合物具有與冬青生菌素類似結(jié)構(gòu)特點(diǎn).抑菌實(shí)驗(yàn)表明，該化合物對于白色念珠菌具有較好的抑制作用，最低抑制濃度為0.05 g/L；對于酵母菌也有一定的抑制效果；對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌基本無抑制作用.

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[責(zé)任編輯：任鐵鋼]

Synthesis and bioactivity of 4-hydroxy-2(1H)-pyridone-

3-carboxamide derivatives

XIN Weixiang,PAN Miao,ZHAO Shengyin*

(CollegeofChemistry,ChemicalEngineeringandBiotechnology,DonghuaUniversity,Shanghai201620,China)

Abstract:4-Hydroxy-2(1H)-pyridone-3-carboxamide,an ilicicolin H analogue,was synthesized with yield of 17% from trans-4-hydroxycinnamic acid through acetylation,substitution,curtius rearrangement,addition,cyclization and so on.Its antifungal and antimicrobial activities were screened by filter paper diffusion method.Results indicated that the compound show potential antifungal activity against Candida albicans and weak activity against Yeast.The compound shows no inhibition effect on E.coli and Staphylococcus aureus.

Keywords:4-hydroxy-2(1H)-pyridone-3-carboxamide; ilicicolin H analogue; synthesis; antifungal activity

作者簡介：辛偉翔(1990-)，男，碩士生，研究方向?yàn)橛袡C(jī)合成與藥物化學(xué).*通訊聯(lián)系人，E-mail:syzhao8@dhu.edu.cn.

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(21072029).

收稿日期：2014-12-12.

中圖分類號：O625.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1008-1011(2015)02-0153-05