絮凝劑發(fā)酵制備條件暨性能研究

馬瑋超 ， 雷磊 ， 陳五嶺

(西北大學 生命科學院 ， 陜西 西安710069)

摘要：以篩出的高效絮凝劑產生菌為對象，利用高嶺土懸液處理前后紫外吸光值的變化測定絮凝效果。絮凝劑主要在對數(shù)期、穩(wěn)定期產生，衰亡期初期積累量達到最大。C∶N為7∶1時最有利于菌體增殖，13∶1時最有利于絮凝劑產生。菌體可利用多種常見基質產生絮凝劑。其化學成分為多糖和蛋白，有效成分主要是多糖。絮凝劑可適應較大范圍pH值、溫度變化，多種金屬陽離子均可加強絮凝效果，最佳投量是0.2 g/L。

關鍵詞：絮凝劑 ； 發(fā)酵 ； 性能

中圖分類號：X703.5文獻標識碼：A

收稿日期：2014-12-21

作者簡介：馬瑋超(1990-)，男，碩士在讀，電話：15991687042；聯(lián)系人：陳五嶺(1954-)，男，教授，博士生導師，從事應用微生物研究，電話：13991993298。

Study on Preparation Conditions of Flocculant by Fermentation and Its Performance

MA Weichao , LEI Lei , CHEN Wuling

(Life Science Institute ， Northeast University ， Xi′an710069 , China)

Abstract:Microbe able to produce flocculant efficiently we choose a selected as research object，its effect is tested by examining variation of ultraviolet absorption of kaolin suspension after being dealt with. Production mainly generated in log phase as well as stationary phase，and attains the maximum in decline phase.When the carbon/nitrogen ratio is 7∶1，cells grow readily,when it is 13∶1，accumulation of flocculant attains the maximum.The microbe is able to utilize medium from wide sources. The flocculant is composed of protein and polysaccharide and main effective chemicals is polysaccharide. The flocculant is geared to high temperature，wide pH value range metal positive ions can reinforce its effect,the best put volume is 0.2 g/L。

Key words:flocculant ; fermentation ; performance

目前大量使用的無機絮凝劑、高分子絮凝劑，存在用量大、易造成二次污染的弊端。微生物絮凝劑本身是生化物質，可自然降解，使用過程均無二次污染，用量小但作用明顯，具有很強的應用價值，可利用液體發(fā)酵手段實現(xiàn)工業(yè)生產[1-3]。

利用發(fā)酵手段生產絮凝劑，主要目的是獲取產物，控制成本。產物積累量與菌體生長周期關系密切，碳氮比可深刻影響菌種擴繁、產物積累。菌種可利用的基質來源決定著生產成本。檢驗產物價值的主要指標是產物受環(huán)境因子的影響程度、投放量、性能穩(wěn)定性[4-7]。鑒于此，將以上問題作為研究重點，在本項目中研究。

1實驗部分

1.1　材料與儀器

儀器：VIS-7220N紫外分光光度計，ZHCHENG振蕩培養(yǎng)箱，PHS-3C型pH計，AIRTECH超凈工作臺，HIRAYAMA高壓蒸汽滅菌釜，TDL-5A菲恰爾離心機，水浴鍋，移液槍，電子天平，62 μm(230目)篩。

菌株：本實驗室自西北大學垃圾填埋場滲液中篩選的一株高效絮凝劑產生菌，按《伯杰氏系統(tǒng)細菌手冊第八版》生理生化鑒定，確認為一株芽孢桿菌(Bacillus. spp)。

試劑：去離子水，乙醇，丙酮，高嶺土，蛋白酶K，牛血清蛋白，葡萄糖，硫酸銅，苯酚，酒石酸鉀，燒堿，鹽酸。

碳源：乳糖，蔗糖，麥芽糖，紅薯粉，草酸鈉，乳酸鈉。

氮源：魚粉，花生粉，玉米漿。尿素，硫酸銨，氯化銨。

培養(yǎng)條件：175 r/min，pH值為8 ，溫度32 ℃。

1.2　絮凝劑精提方法

取發(fā)酵液，燒堿質量分數(shù)為3%，充分攪拌，4 000 r/min離心15 min后取上清液。用95%乙醇調乙醇濃度至70%，冰箱冷凍至4 ℃保持5 h，離心棄去上清液。用丙酮調濃度至90%，離心得沉淀。取少許去離子水透析2～3次，去除溶液中所含鹽分，冷凍干燥得到精提絮凝劑。

1.3　絮凝活性測定

高嶺土高溫烘焙，230目過篩后，配置為0.5%質量比的懸液。將待檢驗發(fā)酵液加入懸濁液中，快速攪拌1 min，再緩慢攪拌5 min，用紫外分光光度計在550 nm波長處，按空白對照(相同處理時間內高嶺土自然沉降為對照)調零后，測定處理前后OD值。

R=(A-B)/A

式中，R為絮凝率，A為處理前光吸收值，B為處理后光吸收值。以R值大小反映絮凝活性。

1.4　絮凝劑積累與菌體生長關系測定

添加葡萄糖12.5 g，硝酸銨2.5 g，按1.1中條件培養(yǎng)，每隔10 h，在620 nm(本菌株最大光吸收波長)處測定發(fā)酵液光吸收值(以未接種發(fā)酵液空白對照)。測定發(fā)酵液絮凝率，得到最大積累量達到時間。

1.5　基質影響測定

1.5.1碳氮比影響測定

定總基質量15 g，按設定的梯度碳氮比， 1.1中培養(yǎng)條件，以葡萄糖為碳源，硝酸銨為氮源，測定絮凝率、OD620的不同。

1.5.2基質成分影響測定

在產物積累的最佳碳氮比下，按1.1中條件培養(yǎng)，測定氮源影響時以葡萄糖為唯一碳源，測定氮源影響時以硝酸銨為唯一氮源，分別測定絮凝率。

1.6　絮凝劑性能測定

1.6.1絮凝劑有效成分測定

蛋白含量采用雙縮脲法測定。按濃度梯度0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/L配制牛血清標準溶液1 mL，分別添加4 mL雙縮脲溶液(去離子水溶解1.5 g硫酸銅，6 g酒石酸鉀，再添加15 mL 20%燒堿，定容至100 mL)，振蕩后靜置30 min，540 nm處測光吸收值。

多糖含量采用苯酚硫酸法測定。按濃度梯度0、1、2、3、4、5、6 mg/L配制葡萄糖標準溶液2 mL，分別添加5 mL 98%濃硫酸，1 mL 6%苯酚，振蕩后靜置30 min。490 nm處測光吸收值。利用Eexcel 2003軟件生成以上二者標準曲線。取精提絮凝劑0.1 g，溶于20 mL去離子水，再取1 mL溶液，去離子水定容至100 mL。取1、2 mL此溶液分別經雙縮脲法、苯酚硫酸法，測定光吸收值，代入標準曲線公式，得到蛋白、多糖濃度，換算即可得二者在絮凝劑中的百分含量。

取0.1 g絮凝劑溶解于40 mL去離子水，用移液槍取10 μL蛋白酶K加入溶液，充分振蕩，水浴保溫處理30 min。再取1 mL溶液加于14 mL高嶺土懸液中，測定絮凝率，即可確定有效成分。

1.6.2環(huán)境因子影響測定

測定基質碳氮比、成分影響時，取1 mL發(fā)酵液滴于14 mL高嶺土懸濁液中，水調溫30 ℃，調pH值為7。

測熱穩(wěn)定性時，最佳碳氮比下培養(yǎng)，調pH值為7，絮凝劑分別60、70、80、90、100 ℃下水浴30 min后使用。

測pH值變化的影響時，在最佳碳氮比下培養(yǎng)，30 ℃下調至對應pH值，靜置30 min。

測金屬陽離子影響時，最佳碳氮比下培養(yǎng)，分別加0.1 mol/L MgCl2和CaCl2，0.2 mol/L NaCl和KCl，0.067 mol/L FeCl3和AlCl3溶液10 mL，發(fā)酵液1 mL于139 mL高嶺土懸濁液當中。調pH值為7，水浴調溫30 ℃。

1.6.3最佳投料量測定

0.1 g精提絮凝劑溶于40 mL蒸餾水配成溶液。依次向49、48、47、46、45、44、43、42 mL高嶺土懸濁液添加1、2、3、4、5、6、7、8 mL溶液，水浴調節(jié)溫度至30 ℃，pH值為7，測定絮凝率，得到最佳投量后換算為每升投量克數(shù)。

1.6.4絮凝劑性能穩(wěn)定性測定

連續(xù)轉接菌種于牛肉膏蛋白胨斜面上，每培養(yǎng)1 d記為1代，記第1代為G1。每隔3代取一株菌最佳碳氮比下發(fā)酵培養(yǎng)，精提絮凝劑。分別提取對應代數(shù)發(fā)酵液絮凝劑0.1 g，溶解于40 mL去離子水中，再取1 mL溶液加于14 mL高嶺土懸液中測定絮凝率，水浴調溫至30 ℃，pH值為7。利用SPSS20.0進行單樣本T檢驗，測定性能、穩(wěn)定性。

2結果和分析

2.1　絮凝劑積累與菌體生長關系測定

絮凝劑積累與菌體生長關系測定結果見圖1。

由圖1可知，菌體對數(shù)期(1～20 h)絮凝劑迅速增長，在穩(wěn)定期(20～80 h)積累速度明顯放緩，衰亡期(80 h后)初期積累量達到最大，而在衰亡期迅速下降。說明絮凝活性物質應當是伴隨菌體生活始終產生的物質，對數(shù)期菌體濃度不大，產物迅速積累。

圖1　絮凝劑積累與菌體生長的關系

穩(wěn)定期積累放緩可能是因為絮凝劑影響到了菌類正常生活，分泌降解酶使之略有消解。而衰亡期初期積累量最大，應當是菌體裂解釋放產物所致，隨后積累量迅速下降，應當是環(huán)境惡化，產物成為營養(yǎng)源被分解利用。因此，最佳放罐時間是衰亡期的初期，生產中可通過監(jiān)控OD值控制放罐時間。

2.2　基質對產物積累影響

2.2.1碳氮比的影響

碳氮比影響的測定結果如表1～3所示。

表1　碳氮比的影響

由表1可知，碳氮比為12∶1時絮凝性能最佳，碳氮比為8∶1時菌體細胞最多。在此基礎上設置更小梯度進一步研究。

表2　碳氮比對菌體生長影響

表3　碳氮比對絮凝劑積累影響

由表2、表3結果可知，擴繁菌體的最佳碳氮比為7∶1。實際生產中適合作為種子發(fā)酵時的基質投料參數(shù)。積累絮凝劑的最佳碳氮比是13∶1，實際生產中適合作為絮凝劑發(fā)酵積累過程的基質投料參數(shù)。

2.2.2基質成分的影響

表4　碳源對絮凝劑積累的影響

由表4可知，菌株可利用多種常見碳源高效積累絮凝劑，其中蔗糖效果最佳，而葡萄糖盡管效果略低，但可結合工業(yè)上廣泛應用的淀粉糖化技術實現(xiàn)規(guī)模生產。草酸鈉、乳酸鈉兩種有機酸鹽明顯不利于產物積累。

表5　氮源對絮凝劑積累的影響

由表5可知，多種常見有機、無機氮源均有利于產物高效積累，其中魚粉效果最佳，可能是因為其由動物組織制成，富含生長因子的原因。實際生產中可根據(jù)各原料的實際成本和產品效益選擇適當?shù)奶荚础⒌唇M織生產。

2.3　環(huán)境因子對性能影響

2.3.1絮凝劑有效成分測定

按1.6.1方法，測定不同濃度標準溶液下的吸光值，結果如表6、表7所示。并得到對應標準曲線。蛋白標準曲線如圖2所示，葡萄糖標準曲線如圖3所示。

表6　不同濃度牛血清蛋白對應吸光值

圖2　牛血清蛋白標準曲線

編號0123456濃度/mg·L-101.02.03.04.05.06.0吸光值0.0730.1830.3050.3940.5120.6240.73200.1100.2320.3210.4390.5510.659

圖3　葡萄糖標準曲線

絮凝劑稀釋溶液分別利用雙縮脲法、硫酸苯酚法測定蛋白、多糖含量，測定處理后的絮凝劑溶液光吸收值1.228、0.813。分別代入對應的標準曲線公式，得蛋白含量為3.462 mg/L，多糖含量為7.42 mg/L，每升發(fā)酵液中共提取2.51 g產品，換算后每升發(fā)酵液提取絮凝劑可得多糖1.49 g(59.36%)，含蛋白0.87 g(34.62%)。

圖4　絮凝劑蛋白酶處理前后絮凝活性變化

如圖4所示，廣譜蛋白酶K處理后，絮凝劑的絮凝效果略微有所下降，但下降值遠遠低于蛋白含量(34.66%)，說明絮凝劑活性成分由多糖和蛋白類物質組成，但主要的活性成分是多糖類物質。

2.3.2絮凝劑熱穩(wěn)定性

由于微生物絮凝劑的化學本質是生化物質，較高的溫度能夠極大的影響其化學結構穩(wěn)定性，進而影響絮凝活性(見圖5)。由圖5可知，經60～80 ℃熱處理后，絮凝劑的絮凝效果幾乎不變，而經過90、100 ℃熱處理后，絮凝效果略有下降。結合2.3.1中絮凝劑主要有效成分為多糖類物質，并含有蛋白的結果，應當是絮凝劑中的蛋白質成分在高溫下變性，會導致其失去絮凝活力?？芍跄齽┬阅芫哂休^好的熱穩(wěn)定性，沸水處理后性能下降亦不明顯。

圖5　絮凝劑熱穩(wěn)定性

2.3.3pH值對絮凝活性的影響

圖6　pH值對絮凝活性的影響

pH值對絮凝活性的影響如圖6所示。強酸環(huán)境下，絮凝劑絮凝活性受到強烈抑制，隨著pH值逐漸升高，絮凝活性迅速提高，pH值大于5后達到峰值。原因可能是，絮凝活性的實現(xiàn)主要是依靠官能團的電解，絮凝劑是弱酸性電解質，強酸環(huán)境抑制了其電解。pH值過高(大于13)時絮凝活性略微下降，可能是絮凝劑的蛋白組分被破壞，導致絮凝活性略有下降。但絮凝劑在pH值5～14絮凝活性均在80%左右。具有克服目前大量應用的高分子絮凝劑、無機絮凝劑使用pH值范圍較窄缺陷的潛在價值[8]。

2.3.4金屬離子對絮凝活性影響

圖7　金屬陽離子對絮凝活性的影響

Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Fe3+、Al3+均可顯著增強絮凝劑的絮凝效果。其中鈉、鉀離子促進效果相對有限，鈣離子促進效果最佳。實際應用中，鋁有較大的毒性，危害人體健康，鈉、鉀促進效果較差，鐵的著色效果較強，可考慮使用鎂、鈣鹽類作為助劑，與微生物絮凝劑復配，達到最佳的絮凝效果。

2.4　絮凝劑添加量對絮凝率的影響

絮凝劑添加量對絮凝率的影響如圖8所示。

圖8　絮凝劑添加量對絮凝活性影響

由圖8可知，絮凝劑溶液添加1～4 mL時，絮凝活性與添加量成正比，超過4 mL反而下降。4 mL時達到絮凝率85.2%。經過換算最佳的投量為0.2 g/L。這是絮凝劑通過破壞懸濁物質的穩(wěn)定結構使其從分散系中沉淀出來。過高濃度的絮凝劑濃度，反而使得沉淀重新形成穩(wěn)定懸濁物。

2.5　絮凝劑性能穩(wěn)定性分析

按1.6.4中方法，測定本菌的發(fā)酵液絮凝活性為86.3%。見表8。

表8　傳代菌所產絮凝劑活性變化

經單樣本T檢驗，Sig為0.889，遠大于0.05，說明各傳代菌株產生的絮凝劑性能差異不顯著，產品性能穩(wěn)定。這對于化工產品性質均一、穩(wěn)定的保持具有很強的實際意義，也有利于處理時投料量的把握。

3結論

絮凝劑最大產量在衰亡初期達到，因此衰亡期初期適合作為放罐時間。絮凝劑產生菌可適應多種常見基質，便于控制成本。菌體擴繁的最佳碳氮比是7∶1，最佳產物積累碳氮比是13∶1。絮凝劑可適應較廣pH值，高溫處理后絮凝活性變化不大。在強酸性環(huán)境下絮凝活性受到強烈抑制，pH值超過5后達到最大絮凝活性，過高堿性環(huán)境下則活性略下降。高溫處理后絮凝活性變化不大。多種金屬陽離子均對絮凝效果有顯著地促進作用。絮凝劑的最佳投料量是0.2 g/L，用量過大反而使得絮凝效果下降。菌種所產絮凝劑性能穩(wěn)定，適合生產應用。

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