張康逸 宋范范 張薇薇 何夢影 康志敏

響應(yīng)面法優(yōu)化醇相體系制備高純甘油磷脂酰肌醇的研究

張康逸1宋范范1張薇薇2何夢影1康志敏1

（河南省農(nóng)科院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究所1，鄭州 450003）
（鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院2，鄭州 450002）

在醇相體系中研究了甲醇鈉催化磷脂酰肌醇（Phosphtidylinositol，PI）制備甘油磷脂酰肌醇（Glycerylphosphoinositol，GPI）的效果。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面設(shè)計軟件對反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到最佳反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度35℃，反應(yīng)時間2.59 h，催化劑添加量3.50 mL，料液比1∶2.22（m／V），在此條件下，PI轉(zhuǎn)化率和GPI得率分別為92.16%和84.31%。經(jīng)過樹脂柱色譜和硅膠柱色譜純化后，GPI的純度和回收率可達(dá)到98.71%和72.10%，為規(guī)?；苽銰PI提供了數(shù)據(jù)支撐和技術(shù)支持。

大豆粉末磷脂 磷脂酰肌醇 甘油磷脂酰肌醇 甲醇鈉

甘油磷脂酰肌醇（Glycerylphosphoinositol，GPI）普遍存在于真核生物中，GPI和有關(guān)的糖結(jié)合物可對宿主的先天和獲得性免疫系統(tǒng)起到調(diào)節(jié)作用，對血栓、肝硬化及癲癇的發(fā)作等起到預(yù)防作用［1］。同時，GPI在人體內(nèi)的生物合成與維持血液凝固和保證神經(jīng)系統(tǒng)的正常息息相關(guān)［2－3］。因此，GPI的研究對于保健和醫(yī)藥等行業(yè)具有重要的價值［4－6］。目前，GPI合成方法的報道很少，而關(guān)于磷脂衍生物甘油磷脂酰膽堿（Glycerylphosphorylcholine，GPC）和甘油磷脂酰乙醇胺（glycerylphosphorylcholine，GPE）的研究較多，主要方法有化學(xué)水解法［7］、非水相酶法［8］、化學(xué)合成法［9］等。近年來，一些學(xué)者對化學(xué)水解制備GPC的方法研究較多。張?zhí)鹛鸬龋?0］以氫氧化四丁基銨為催化劑，甲醇為溶劑，催化制備GPC，產(chǎn)物收率可達(dá)89.20%。孟宗等［11］以甲醇鈉為催化劑，對粉末磷脂進(jìn)行醇解，同時制備含有GPC和GPE的混合物，在最佳條件下，GPC和GPE的得率分別為93.60%和88.69%?；瘜W(xué)水解法常以大豆粉末磷脂為原料，要得到較高純度的產(chǎn)品需對反應(yīng)物進(jìn)行后續(xù)分離和純化，工藝步驟復(fù)雜。

本研究采用甲醇鈉為催化劑，用粗PI作為催化底物，在醇相體系中對粗PI進(jìn)行醇解制備GPI，并利用響應(yīng)面軟件對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳工藝條件。通過對化學(xué)醇解法制備GPI進(jìn)行研究，不僅可為工業(yè)制備GPI提供數(shù)據(jù)支撐，也可為PI改性技術(shù)的進(jìn)展提供新的研究方向。

1 材料及方法

1.1 材料及試劑

大豆粉末磷脂（純度≥96%；磷脂酰膽堿30%、磷脂酰乙醇胺25%、磷脂酰肌醇25%、溶血磷脂酰乙醇胺0.5%）：天津市博帥工貿(mào)有限公司；GPI標(biāo)準(zhǔn)樣品：福州美樂蓮有限公司；甲醇（色譜純）：美國Honeywell公司；無水乙醇（純度≥99%）、氨水（NH3含量≥25%）、甲醇（純度≥99%）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂001×7（H型）：安徽皖樹化工銷售有限公司；層析硅膠（100～200目）：青島海洋化工廠分廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260型高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司；Bruker AVANCE AV－500核磁共振儀：瑞士Bruker公司；DF－101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：河南予華儀器廠；TDL－5A離心機(jī)：上海菲恰爾分析儀器有限公司；玻璃層析柱：上海滬西分析儀器廠；HL－2恒流泵：上海華巖儀器設(shè)備有限公司；自動部分收集器：上海青浦滬西儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 HPLC－ELSD方法

色譜柱：ZORBAXRX－SIL（4.6 mm ×250 mm，5μm），柱溫35℃，進(jìn)樣量20μL，漂移管溫度30℃；流動相∶溶劑A（甲醇∶水＝8∶1，V∶V），溶劑B（甲醇），流量1.0 mL／min；梯度洗脫程序：0 ～10.0 min，60%～40%A；10.0 ～20.0 min，40%A；20.0 ～20.1 min，40%～60%A；20.1 ～25.0 min，60%A。

1.3.213C NMR方法

將純化后的樣品溶于氘代氯仿中，以四甲基硅烷（TMS）做內(nèi)標(biāo)，核磁共振儀測定它的碳譜（13C NMR）。13C NMR 化學(xué)位移分析如下：13C NMR（100 MHz，CDCl3），δC ＝73.378（C －2）、68.211（C －1）、64.695（C －2′）、62.065（C －3）、56.568（C －1″，2″，3″）和42.753（C －1′）。樣品分析結(jié)果與GPI標(biāo)樣的13C NMR一致。

1.3.3 粗PI的制備方法

稱取一定量粉末磷脂，加入到40℃，10倍體積的堿性乙醇（無水乙醇∶氨水＝100∶3，V∶V）中，攪拌1 h，離心分離上清液，將沉淀與堿性乙醇再混合，重復(fù)操作2次。將不溶物在60℃下真空干燥。

1.3.4 單因素試驗

稱取25.0 g粗PI溶于100 mL甲醇，在室溫水浴中均質(zhì)，加入2.5 mL甲醇鈉，反應(yīng)3 h，取反應(yīng)液，將反應(yīng)液用甲醇稀釋并過濾后進(jìn)行檢測。固定其他條件，分別考察反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、料液比、催化劑添加量對反應(yīng)效果的影響，重復(fù)3次。

1.3.5 響應(yīng)面試驗

采用Design Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計，根據(jù)Box－Behnhen的中心組合設(shè)計原理，以反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、催化劑添加量及料液比4個因素為自變量，以GPI得率為考察指標(biāo)（Y）來進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、催化劑添加量及料液比4個自變量分別以A、B、C、D表示，因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平表

1.3.6 樹脂柱色譜去除Na＋

采用濕法裝柱，先將樹脂浸入水中，然后將樹脂裝進(jìn)層析柱中，除去樹脂中的Na＋。陽離子交換樹脂的預(yù)處理：先用2倍樹脂體積的4%HCl溶液浸泡3 h，用去離子水洗至中性；再用相同體積的4%NaOH溶液浸泡4 h，用去離子水洗至中性；最后用相同體積的4%HCl溶液浸泡3 h，用去離子水洗至中性。

1.3.7 硅膠柱色譜純化

稱15 g硅膠，在120℃烘箱中活化30 min，干燥器中冷卻后用濕法裝柱。柱色譜條件：甲醇為洗脫劑，上樣量20 mg／g硅膠，上樣濃度30 mg／mL時，流速2 mL／min。每30 mL洗脫餾分進(jìn)行收集，用HPLCELSD進(jìn)行檢測，直到?jīng)]有GPI的響應(yīng)值為止，將同類型的餾分進(jìn)行合并。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料粉末磷脂和粗PI的HPLC－ELSD色譜圖

由于PE在堿性乙醇中的溶解度高于乙醇，故利用堿性乙醇萃取的方法可有效降低粉末磷脂中的PC和PE，從而得到較高純度的粗PI［12］。由圖1看出，原料粉末磷脂中PI的含量為25%（圖1a），經(jīng)過堿性乙醇萃取后，粗PI含量可達(dá)到62%（圖1b）。

圖1 原料和粗PI的色譜圖

2.2 單因素試驗

2.2.1 反應(yīng)時間對醇解反應(yīng)的影響

圖2 時間對GPI轉(zhuǎn)化率和得率的影響

由圖2可以看出，隨著時間的延長，PI的轉(zhuǎn)化率和GPI的得率逐漸提高，當(dāng)反應(yīng)時間超過5 h后，二者增加并不明顯，而GPI的得率略微下降，這可能是過度反應(yīng)導(dǎo)致GPI開始分解造成的。故最佳反應(yīng)時間選擇5 h，在該條件下，PI的轉(zhuǎn)化率和GPI的得率分別為90.53%和83.12%。

2.2.2 反應(yīng)溫度對醇解反應(yīng)的影響

由圖3可以看出，反應(yīng)溫度的變化對醇解反應(yīng)的影響是比較大的。溫度不僅可以影響催化效率，而且還會影響反應(yīng)體系的黏度和底物的溶解度。溫度過低，不利于反應(yīng)體系的傳質(zhì)與擴(kuò)散，溫度升高會造成甲醇揮發(fā)，降低反應(yīng)效率。當(dāng)反應(yīng)溫度超過35℃時，PI轉(zhuǎn)化率和GPI得率開始明顯下降，這一結(jié)果與甲醇的揮發(fā)有直接關(guān)系，因為甲醇的減少會導(dǎo)致反應(yīng)體系變得黏稠，不利于催化劑和反應(yīng)原料之間的接觸。故選擇35℃為最佳反應(yīng)溫度，在該溫度下，PI的轉(zhuǎn)化率和GPI的得率分別為82.08%和73.06%。

圖3 溫度對GPI轉(zhuǎn)化率和得率的影響

2.2.3 料液比對醇解反應(yīng)的影響

一般來說，料液比對催化效果的影響非常重要，當(dāng)溶劑量較小時，反應(yīng)原料和催化劑不能得到充分混勻，且體系有可能結(jié)塊使催化效果下降，當(dāng)溶劑量過大時，不但會造成資源浪費(fèi)，還會使反應(yīng)原料和催化劑得到稀釋。故一個合理的料液比對工業(yè)化生產(chǎn)具有重要的意義。

圖4 料液比對GPI轉(zhuǎn)化率和得率的影響

由圖4看出，隨著料液比的增加，PI轉(zhuǎn)化率和GPI得率出現(xiàn)下降趨勢，這是因為甲醇量得逐漸增大會對反應(yīng)原料和催化劑起到稀釋作用，使原料和催化劑濃度下降，最終導(dǎo)致反應(yīng)效率降低。然而，當(dāng)料液比大于1∶1（m／V）時，體系變得非常黏稠，粗PI結(jié)成團(tuán)狀，不能充分?jǐn)U散到體系中，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率和得率較低。綜合考慮，選擇最佳料液比為1∶1。

2.2.4 催化劑添加量對醇解反應(yīng)的影響

甲醇鈉因其催化效率高、引發(fā)反應(yīng)溫度低及成本低的原因已廣泛應(yīng)用于脂質(zhì)改性中［13］。由于甲醇鈉極易發(fā)生水解，故反應(yīng)體系要嚴(yán)格控制成為無水環(huán)境。由圖5看出，隨著甲醇鈉添加量得增加，PI轉(zhuǎn)化率和GPI得率隨之增加，當(dāng)甲醇鈉添加量超過2.5 mL時，PI轉(zhuǎn)化率和GPI得率不再增加反而開始下降?？赡苁沁^多的甲醇鈉促使反應(yīng)生成的GPI繼續(xù)分解，造成GPI得率降低。綜合考慮，選擇甲醇鈉添加量為2.5 mL。

圖5 催化劑添加量對GPI轉(zhuǎn)化率和得率的影響

2.3 響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果分析

2.3.1 響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果

響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

表2 （續(xù)）

2.3.2 數(shù)學(xué)模擬及方差分析

響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.0軟件進(jìn)行分析，建立二次多項式回歸方程?；貧w方程如式（1）所示。

式中：Y 為響應(yīng)值，Xi和Xj為自變量，βo、βi、βii及βij分別為截距、一次項、二次項及交互項回歸項系數(shù)。良好的擬合模型應(yīng)具有較高的判定系數(shù)R2，較低的絕對平均偏差和良好的方差分析結(jié)果。

對表2中響應(yīng)面試驗結(jié)果的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到GPI得率對自變量A、B、C、D的二次多項回歸方程如式（2）所示。

F值是用來判定回歸方程中各變量對響應(yīng)值影響的顯著性，其值越小說明該模型越顯著。從表3可知，P＜0.05，由此可知此模型顯著，失擬項不顯著。這說明使用此回歸方程擬合的4個因素與GPI得率之間的關(guān)系是可行的，并能夠?qū)Υ冀夥磻?yīng)制備GPI的實際情況進(jìn)行預(yù)測。各個因素之間的交互作用響應(yīng)面圖如圖6所示。由圖6a可以看出，在反應(yīng)溫度33.00～37.00℃和時間2.50～3.50 h時，PI的純度較高。當(dāng)溫度一定時，隨著反應(yīng)時間的延長，PI純度出現(xiàn)先增加后降低的趨勢，這主要與反應(yīng)溶劑甲醇的沸點有關(guān)系，反應(yīng)時間越長，甲醇揮發(fā)的越多，體系黏稠，不利于反應(yīng)的進(jìn)行。由圖6b看出，溫度與催化劑之間的交互作用影響較大。在反應(yīng)溫度30.00～35.00℃和催化劑添加量2.70～3.50 mL時，PI的純度較高。由圖6c看出，溫度和料液比之間的交互作用影響也較大，在溫度30.00～35.00℃和料液比1.00～2.00時，PI純度較高。由圖6d看出，在時間2.50～3.50 h和料液比1.00～2.00時，PI純度較高。當(dāng)反應(yīng)時間一定時，隨著料液比的增加，PI純度逐漸降低，因為體系中過高的溶劑對體系中催化劑和原料起到稀釋作用而不利于反應(yīng)。數(shù)據(jù)分析表明：此回歸方程中一次項C、二次項A2、B2對EF轉(zhuǎn)化率也有顯著的影響。4個因素對GPI得率影響大小的順序：催化劑添加量＞料液比＞反應(yīng)溫度＞反應(yīng)時間。

圖6 部分交互作用的響應(yīng)面圖

表3 方差分析表

2.3.3 條件優(yōu)化及模型驗證

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化的解決方案中選取的最優(yōu)反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度35℃，反應(yīng)時間2.59 h，催化劑添加量3.50 mL，料液比1∶2.22（m／V）。在此工藝條件下得到的驗證試驗的GPI得率為（84.31±1.1）%（預(yù)測值為83.56%），這說明試驗結(jié)果與模型預(yù)測結(jié)果具有良好的相關(guān)性，因此，該模型可以較成功的預(yù)測醇解反應(yīng)制備GPI的過程。

2.4 柱色譜純化和13C NMR定性分析

由于反應(yīng)結(jié)束后，溶液中存在一定量的Na＋，會影響產(chǎn)品的質(zhì)量和穩(wěn)定性，因此有必要用陽離子交換樹脂對Na＋進(jìn)行去除。Tronconi等［14］采用離子交換樹脂法在粗磷脂的水解產(chǎn)物中成功分離出GPC，所分離的產(chǎn)品純度較高，并可同時分離出副產(chǎn)品。在前期研究的基礎(chǔ)上［15］，當(dāng)Na＋初始濃度為876 μg／mL，吸附流速1 mL／min，處理反應(yīng)液能力28.08 mL／g的條件下，經(jīng)過處理的洗脫液中的Na＋殘留為8.2 ppm。為了得到更高純度的GPI，需通過硅膠柱色譜對濃縮后的樣品進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，參考之前GPC的分離方法［16］，當(dāng)洗脫流速1.5 mL／min，上樣量和上樣初始濃度為20 mg／g硅膠和10 mg／mL的條件下，GPI的純度和回收率可達(dá)到98.71%和72.10%。經(jīng)過柱色譜純化后的GPI的HPLC－ELSD色譜圖和13C NMR如圖7和圖8所示。樣品的13C NMR分析結(jié)果與GPI標(biāo)樣的一致。

圖7 純化后GPI的HPLC－ELSD圖

圖8 純化后GPI的核磁碳譜圖

3 結(jié)論

在醇相體系中研究了甲醇鈉催化制備GPI的研究，通過單因素試驗及響應(yīng)面設(shè)計，得出醇相體系中合成GPI的最佳反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度35℃，反應(yīng)時間2.59 h，催化劑添加量3.50 mL，料液比1∶2.22（m／V），在此最佳工藝條件下，得到PI轉(zhuǎn)化率和GPI得率分別為92.16%和84.31%。經(jīng)過樹脂柱色譜和硅膠柱色譜純化后，GPI的純度和回收率可達(dá)到98.71%和72.10%。結(jié)果表明，甲醇鈉醇解制備GPI的方法是可行的，該方法成本較低，操作簡單，可為GPI的工業(yè)化制備提供技術(shù)參考。

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Optimization for Preparation of High Purity Glycerylphosphoinositolin Alcohol Phase System by Response Surface Methodology

Zhang Kangyi1Song Fanfan1Zhang Weiwei2He Mengying1Kang Zhimin1
（Institute of Agricultural Products Processing，Henan Academy of Agricultural Sciences1，Zhengzhou 450003）
（School of Food and Bioengineering，Zhengzhou University of Light Industry2，Zhengzhou 450002）

The effect of preparation of glycerylphosphoinositol（GPI）by phosphtidylinositol （PI）catalyzed by sodium methoxide in methanol phase is investigated.The optimum conditions are obtained by response surface methodology based on single factor experiment as follows：reaction temperature 35℃，reaction time 2.59 h，dosage of catalyst 3.50 mL，solid －liquid ratio 1∶2.22.Under the above condition，the conversion rate of PI and the yield of GPI are 92.16%and 84.31%respectively.After the purification of resin and gel column chromatography，the final product GPI is obtained at 98.71%purity and 72.10%recovery.These results provide fundamental data and theoretical support for the further industrialization of GPI.

soybean lecithin powder，phosphtidylinositol，glycerylphosphoinositol，sodium methoxide

TS229

A

1003－0174（2016）07－0064－06

國家自然科學(xué)基金（31301502）

2014－11－12

張康逸，男，1981年出生，博士，脂質(zhì)科學(xué)

宋范范，女，1988年出生，碩士，脂質(zhì)科學(xué)