肖玲玲，湯金婷，龔大春

纖維素酶高效水解麥稈的工藝研究

肖玲玲1，湯金婷2，龔大春2

（1. 湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北 宜昌 443002；2. 三峽大學(xué)，湖北 宜昌 443002）

以纖維素酶水解蒸汽爆破麥稈的過(guò)程為研究對(duì)象，考察了底物濃度、纖維素酶用量、β-葡萄糖苷酶裝載量以及化學(xué)激活劑對(duì)麥稈水解的影響。結(jié)果表明，高底物濃度下的最佳酶解工藝條件為底物（麥稈）濃度20%，酶裝載量（U/g纖維素）：濾紙酶活45、β-葡萄糖苷酶25、木聚糖酶800，0.1 mmol/L Mg2+、0.1 mmol/L Co2+、10 mmol/L Fe3+，1 g/L PEG2000、1 g/L Tween80和1 g/L山梨醇，攪拌速度120～150 r/min，分批補(bǔ)料，pH4.8，50℃，水解時(shí)間144 h。在此條件下，還原糖濃度達(dá)115.43 g/L，葡萄糖濃度達(dá)88.39 g/L，轉(zhuǎn)化率也分別達(dá)到78.04%和88.73%。

氣爆麥稈；纖維素酶；高效水解

隨著不可再生能源的日趨枯竭，可再生能源的開發(fā)利用迅速崛起。其中，利用木質(zhì)纖維素可再生生物質(zhì)為原料生產(chǎn)燃料乙醇工藝的研究，已成為當(dāng)前各國(guó)研究的重點(diǎn)。纖維素乙醇的核心技術(shù)包括原料預(yù)處理、纖維素水解、酒精發(fā)酵及后處理[1-3]。其中纖維素水解為可發(fā)酵糖是纖維素乙醇煉制過(guò)程中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。

纖維素水解反應(yīng)為非均相反應(yīng)，因此，酶與底物的有效吸附量是控制水解速率、產(chǎn)率的重要因素。低底物濃度下的糖化，由于酶與底物的充分接觸，酶能及時(shí)從底物作用位點(diǎn)上解吸，重新開始與新的位點(diǎn)結(jié)合，有效地發(fā)揮催化作用，水解率能夠達(dá)到90%以上[4]。但是，低底物濃度時(shí)，得到的產(chǎn)物濃度偏低，不利于后期發(fā)酵及產(chǎn)物提純，因此提高單位體積中可發(fā)酵糖濃度勢(shì)在必行。

本文通過(guò)改變底物（氣爆麥稈）濃度、改善傳質(zhì)、調(diào)整酶系組成、利用化學(xué)激活劑調(diào)控等手段對(duì)纖維素酶解過(guò)程進(jìn)行了優(yōu)化，得出最佳酶解工藝條件，以期為木質(zhì)纖維素的高效利用提供理論依據(jù)與技術(shù)參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

蒸汽爆破處理后的麥稈，安琪酵母股份有限公司提供；纖維素酶ZSS-600，山東澤生生物科技有限公司；木聚糖酶，山東澤生生物科技有限公司；黑曲霉酶液，三峽大學(xué)艾倫·麥克德爾米德再生能源研究所提供[5]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

取經(jīng)過(guò)蒸汽爆破處理后的麥稈，通過(guò)添加不同濃度的纖維素酶、β-葡萄糖苷酶及化學(xué)激活劑，于50℃、pH4.8的條件下進(jìn)行水解，水解到預(yù)定時(shí)間后，測(cè)定水解液中還原糖濃度、葡萄糖濃度，計(jì)算還原糖轉(zhuǎn)化率和葡萄糖轉(zhuǎn)化率。

1.3 分析方法

1.3.1 纖維素酶酶活測(cè)定

將酶液或固態(tài)酶稀釋一定倍數(shù)后，吸取0.5 mL，加入相應(yīng)底物及緩沖液，混勻，置于50℃水浴中反應(yīng)30 min后，迅速加入DNS試劑1.0 mL，沸水浴中加熱10 min，取出在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)OD值，通過(guò)線性回歸方程求出還原糖的含量。酶活定義：在50℃、pH4.8的條件下，每分鐘從底物中釋放1 μmol還原糖所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位U。

1.3.2 還原糖含量的測(cè)定

采用DNS法測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 底物濃度對(duì)纖維素酶解的影響

酶裝載量（U/g纖維素）：β-葡萄糖苷酶60，濾紙酶活60，木聚糖酶800；pH4.8，50℃條件下，水解144 h，研究不同底物濃度對(duì)纖維素酶解的影響。結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，底物濃度大于5%時(shí)，傳質(zhì)受阻，糖濃度反而降低，轉(zhuǎn)化率也急劇下降，底物濃度為10%時(shí)，還原糖轉(zhuǎn)化率降至26.19%，葡萄糖轉(zhuǎn)化率僅為39.1%。分析原因可能是底物濃度的增加導(dǎo)致傳質(zhì)受阻，底物與酶的接觸機(jī)會(huì)反而減少，有效結(jié)合幾率降低，限制了酶的催化作用。

圖1 底物濃度對(duì)纖維素酶解的影響

圖2 底物濃度對(duì)纖維素酶解的影響

為了改善傳質(zhì)，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行了兩點(diǎn)調(diào)整：1）增加機(jī)械攪拌，轉(zhuǎn)速控制在120～150 r/min；2）采用分批補(bǔ)料，為了保證后期加入的底物能充分水解，所以要求底物在48 h內(nèi)補(bǔ)完。調(diào)整后，酶解結(jié)果如圖2所示。

由圖2可看出，適當(dāng)?shù)臄嚢韬头峙a(bǔ)料條件下，底物濃度增至20%前，糖濃度隨底物濃度的增加而明顯增大，還原糖濃度最大達(dá)到115.12 g/L，葡萄糖濃度達(dá)到87.62 g/L，轉(zhuǎn)化率也分別穩(wěn)定在70%和85%以上。再增加底物濃度，糖濃度反而下降。分析原因：一方面固態(tài)物含量過(guò)高，反應(yīng)體系的流變性降低，不利于酶解[6]；另一方面，底物濃度增加，底物抑制和產(chǎn)物抑制加劇，尤其是底物中呋喃、酚酸類等物質(zhì)對(duì)酶有強(qiáng)烈的抑制作用[7]，產(chǎn)物纖維二糖對(duì)內(nèi)切酶、外切酶的阻遏作用也較明顯。

2.2 纖維素酶裝載量對(duì)纖維素酶解的影響

酶裝載量（U/g纖維素）：濾紙酶活30～50，β-葡萄糖苷酶15，木聚糖酶800；pH4.8，50℃條件下，水解144 h，研究纖維素酶裝載量對(duì)纖維素酶解影響。結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，還原糖含量隨纖維素酶量的增加而增加，到濾紙酶活為45 U/g纖維素時(shí)，還原糖濃度為105.98 g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到71.61%，葡萄糖濃度此時(shí)已達(dá)到最大87.00 g/L，轉(zhuǎn)化率為82.66%，此后繼續(xù)加大酶量，還原糖濃度增加，但葡萄糖濃度基本不變。結(jié)果顯示在酶未飽和前，葡萄糖濃度已經(jīng)達(dá)到最大，分析原因可能是由于添加的纖維素酶中β-葡萄糖苷酶量的不足，而導(dǎo)致水解后的纖維二糖、纖維三糖等無(wú)法及時(shí)的轉(zhuǎn)化為葡萄糖。綜合考慮，確定纖維素酶濾紙酶活為45 U/g纖維素。

圖3 纖維素酶裝載量對(duì)纖維素酶解的影響

圖4 β-葡萄糖苷酶裝載量對(duì)纖維素酶水解的影響

2.3 β-葡萄糖苷酶裝載量對(duì)纖維素酶解的影響

酶裝載量（U/g纖維素）：濾紙酶活45，β-葡萄糖苷酶10～35，木聚糖酶800；pH4.8，50℃條件下，水解144 h，研究β-葡萄糖苷酶裝載量對(duì)纖維素酶解影響。結(jié)果如圖4所示。

圖4表明，增加β-葡萄糖苷酶酶活，能促進(jìn)纖維素酶解，葡萄糖濃度增幅較大，還原糖在β-葡萄糖苷酶酶活裝載量低于20 U/g纖維素時(shí)，增幅不大，在25 U/g纖維素時(shí)，可能由于纖維二糖即時(shí)水解為葡萄糖，其反饋抑制減弱，還原糖濃度也隨之提高，此時(shí)，還原糖和葡萄糖濃度都達(dá)到最大，分別為99.61和79 g/L。圖中出現(xiàn)的糖隨β-葡萄糖苷酶酶活升高而降低的現(xiàn)象可能是：為了提高β-葡萄糖苷酶酶活而對(duì)黑曲霉酶液進(jìn)行了一定程度的濃縮，導(dǎo)致其流動(dòng)性降低，粘性增加，從而減少了酶與底物的有效碰觸。

2.4 化學(xué)激活劑對(duì)纖維素酶解的影響

高底物濃度下，纖維素完全水解需要纖維素酶不斷進(jìn)行有效的吸附及解吸附，并保證足夠的酶解活力。然而在酶解過(guò)程中，底物抑制的增加，機(jī)械攪拌的剪切，底物表面的不可逆吸附等都會(huì)使酶失活。因此，尋找合適的化學(xué)激活劑（如金屬離子、表面活性劑等），改善酶與底物結(jié)構(gòu)和作用環(huán)境，激活酶的功能基團(tuán)，保持酶的穩(wěn)定性將有利于纖維素的高效酶解。

2.4.1 金屬離子對(duì)纖維素酶解的影響

多數(shù)人認(rèn)為金屬離子能夠和底物、酶等作用，改變底物或酶的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)或抑制酶解。本文對(duì)幾種常見(jiàn)的金屬離子進(jìn)行了考察，表1所示為添加不同金屬離子（濃度分別為10、100 μmol/L）時(shí)，對(duì)應(yīng)酶解所得的還原糖濃度。

表1 金屬離子對(duì)纖維素酶解影響

由1表可見(jiàn)，Mg2+、Fe2+、Fe3+、Co2+對(duì)酶水解有一定的促進(jìn)作用，對(duì)這幾種離子進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化，結(jié)果如圖5所示。

圖5顯示，Co2+，Mg2+在低濃度（＜1 mmol/L）時(shí)激活作用明顯，分別在0.01、0.1 mmol/L時(shí)，還原糖濃度達(dá)到最大，分別為105.38、107.01 g/L。Fe3+激活作用隨離子濃度增加而增大，10 mmol/L時(shí)激活作用最明顯。Fe2+激活作用不明顯，甚至出現(xiàn)抑制。

圖5 金屬離子對(duì)纖維素酶解的影響

圖6 表面活性劑類對(duì)纖維素酶解的影響

2.4.2 表面活性劑類物質(zhì)對(duì)纖維素酶解的影響

研究表明添加表面活性劑有助于纖維素酶的解吸附，表面活性劑一方面制造了親水環(huán)境，對(duì)酶在纖維素官能團(tuán)上的解吸起到了重要作用[8]。另一方面通過(guò)減少內(nèi)切葡聚糖酶的無(wú)效吸附，使游離的內(nèi)切葡聚糖酶為外切酶提供更多的游離末端，促進(jìn)纖維素的降解。本文考察了聚乙二醇（PEG）2000、油酸、山梨醇、Tween80、十二烷基磺酸鈉（SDS）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）等表面活性劑對(duì)纖維素酶解的影響，結(jié)果如圖6所示。

結(jié)果表明，陰離子表面活性劑SDS和陽(yáng)離子表面活性劑CTAB對(duì)纖維素酶水解都有抑制作用，而非離子表面活性劑PEG2000、油酸、Tween80、山梨醇對(duì)纖維素酶水解有不同程度的促進(jìn)作用，其中1 g/L Tween80、10 g/L PEG2000、1 g/L山梨醇作用最明顯，還原糖濃度分別增加19.06、13.65和9.96 g/L。當(dāng)表面活性劑的濃度超過(guò)臨界濃度則表面活性劑可能與酶蛋白結(jié)合在一起，或是過(guò)多的表面活性劑自聚成膠束，阻止酶與底物的接觸而抑制酶作用。

2.5 條件優(yōu)化后纖維素酶解

對(duì)纖維素濃度、傳質(zhì)、酶組分及裝載量以及化學(xué)激活劑等的優(yōu)化，最終得出的優(yōu)化條件為：底物濃度20%，100 mL黑曲霉液，補(bǔ)加纖維素酶、木聚糖酶至酶裝載量（U/g纖維素）：濾紙酶活45，β-葡萄糖苷酶25，木聚糖酶800，0.1 mmol/L Mg2+、0.1 mmol/L Co2+、10 mmol/L Fe3+，10 g/L PEG2000、1 g/L Tween80和1 g/L山梨醇，攪拌速度120～150 r/min，分批補(bǔ)料，pH4.8，50℃，水解時(shí)間144 h。在此條件下水解結(jié)果如表2所示。

表2 優(yōu)化后條件下纖維素酶解結(jié)果

3 結(jié)論

本文確定了高底物濃度下纖維素酶解過(guò)程，最終確定酶解工藝條件為：250 mL錐形瓶裝液量100 mL，底物SEWS濃度20%，酶裝載量(U/g纖維素)：濾紙酶活45，β-葡萄糖苷酶25，木聚糖酶800，0.1 mmol/L Mg2+、0.1 mmol/L Co2+、10 mmol/L Fe3+，1 g/L PEG2000、1 g/L Tween80和1 g/L山梨醇，攪拌速度120～150 r/min，分批補(bǔ)料，pH4.8，50℃，水解時(shí)間144 h，在此條件下，還原糖濃度達(dá)115.43 g/L，葡萄糖濃度達(dá)88.39 g/L，轉(zhuǎn)化率也分別達(dá)到78.04%和88.73%，為后期發(fā)酵得到較高的酒精濃度提供了較好的條件。

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Study on the Process of Cellulase Hydrolysis of Straw

XIAO Ling-ling1, TANG Jin-ting2, GONG Da-chun2
（1. Hubei Three Gorges Polytechnic, Yichang 443002, China; 2. Three Gorges University, Yichang 443002, China）

The cellulase hydrolysis process of steam explosion of straw as the research object was studied, the substrate concentration, dosage of cellulase, beta glycosidase enzymes loading capacity and the influence of chemical activator on straw hydrolysis. Results showed that high concentration of substrate optimum enzyme hydrolysis conditions for the substrate (straw) concentration 20%, enzyme loading capacity (U/g cellulase) : 45 filter paper enzyme activity, 25 β-Glucosidases activity, 800 xylanase activity, 0.1 mmol/L Mg2+, 0.1 mmol/L Co2+, 10 mmol/L Fe3+, 1 g/L PEG2000, 1 g/L Tween80 and 1 g/L sorbitol, the agitation speed 120～150 r/min, and fed batch cultivation at pH4.8, 50℃ for 144 h. On this condition, the concentrations of the reducing sugar and glucose were achieved 115.43 g/L and 88.39 g/L respectively, the conversations were 78.04% and 88.73% respectively.

gas detonation straw; cellulase; efficient hydrolysis

TQ353

A

1004-8405(2015)02-0008-06

2015-03-20

肖玲玲（1983～），女，湖南常德人，講師，碩士，研究方向：生物化工。xll_tgc@163.com