左乙拉西坦對癲癇大鼠海馬組織中5-HT2A受體表達及其認知功能的影響

聶磊張濤1王海燕鄒艷紅王影李春玉王禹遲瑛嬌趙塔娜趙冬梅

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江佳木斯154002)

摘要〔〕目的探討左乙拉西坦(LEV)對癲癇大鼠海馬組織中5-羥色胺2A(5-HT2A)受體動態(tài)表達及對認知功能的影響。方法108只Wistar大鼠隨機分為對照組(NS)24只、正常給藥組(LEV)24只、癲癇模型組(Li-PILO)30只、癲癇給藥組(Li-PILO+LEV)30只，分別給予LEV組和Li-PILD+LEV組大鼠LEV 200 mg/kg 1次/d灌胃，連續(xù)28 d。采用RT-PCR方法分別在第7、14、28天動態(tài)檢測大鼠海馬組織中5-HT2A受體的表達，Morris水迷宮實驗測試大鼠的空間學習記憶。結(jié)果LEV與NS組5-HT2A受體表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與NS組比較，Li-PILO組在第7天時表達水平降低，且隨時間延長降低水平越明顯，即在第14、28天5-HT2A受體表達水平明顯降低(P<0.05)；與Li-PILO型組比較，Li-PILO+LEV組5-HT2A受體在第7、14、28天表達水平明顯升高(P<0.05)。與Li-PILO組比較，Li-PILO+LEV組的逃避潛伏期明顯縮短、穿越平臺次數(shù)顯著增加(均P<0.05)。結(jié)論LEV的抗癲癇作用可能與通過上調(diào)5HT-2A受體的表達有關，其在抗癲癇的同時還可以改善大鼠的空間學習記憶。

關鍵詞〔〕左乙拉西坦；癲癇；5-羥色胺2A受體；氯化鋰-匹羅卡品

中圖分類號〔〕R742.1〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：黑龍江省衛(wèi)生廳科研課題(No.2013-230)

通訊作者：張濤(1964-)，女，教授，博士，碩士生導師，主要從事抗腫瘤與抗衰老的研究。

1佳木斯大學基礎醫(yī)學院

第一作者：聶磊(1977-)，男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事小兒神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究。

癲癇是兒科常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一〔1，2〕。許多抗癲癇藥物會使患兒的認知功能受到不同程度的損害，因此需要尋求一種既有抗癲癇作用又有腦保護作用的抗癲癇藥物。左乙拉西坦(LEV)抗癲癇機制獨特，通過與中樞神經(jīng)元突觸囊泡蛋白結(jié)合而達到抗癲癇作用。LEV與突觸囊泡蛋白有很高的結(jié)合能力，結(jié)合后可以與抑制神經(jīng)元異常放電，從而發(fā)揮抗癲癇的作用〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)，LEV對于治療多種癲癇發(fā)作類型有顯著效果并有改善認知功能的作用〔4，5〕。本課題通過建立氯化鋰-匹羅卡品(Li-PILO)癲癇大鼠模型，初步探討LEV對癲癇大鼠海馬組織中膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)和5-羥色胺2A(5-HT2A)受體表達及學習記憶功能的影響。

1材料與方法

1.1實驗動物及分組108只清潔級的Wistar大鼠(由大連醫(yī)科大學動物實驗中心提供)，體重(90±10)g，隨機分為對照組(NS)24只、正常給藥(LEV)24只、癲癇模型組(Li-PILO)30只、癲癇給藥組(Li-PILO+LEV)30只。

1.2實驗試劑和癲癇模型建立Li-PILO(Sigma公司)，LEV(UCB S.A.Belgim公司)，RT-PCR試劑盒和引物合成(北京華邁科生物技術有限公司)。動物模型的建立過程參照相關文獻〔6〕并稍有改進，將Li-PILO組及Li-PILO+LEV組大鼠先腹腔注射氯化鋰120 mg/kg，20 h后，再腹腔注射東莨菪堿1 mg/kg拮抗外周膽堿能反應，30 min后再次腹腔注射皮羅卡品80 mg/kg，并觀察大鼠的行為。大鼠的癲癇發(fā)作分級參照RACINE分級，0級：無反應或抽搐停止；Ⅰ級：面部抽動、咀嚼；Ⅱ級：面部抽動、咀嚼、點頭；Ⅲ級：面部抽動、咀嚼、點頭、前肢或后肢抽動；Ⅳ級：面部抽動、咀嚼、點頭、前肢或后肢抽動、多肢抽動或強直；Ⅴ級：全面性強直陣攣發(fā)作。在大鼠癲癇發(fā)作30 min后，立即腹腔注射地西泮(10 mg/kg)終止癲癇發(fā)作。Li-PILO+LEV組在成功建立模型后的4 h給予LEV 200 mg/kg，1次/d，連續(xù)28 d，動態(tài)觀察并分別于第7、14、28天提取海馬組織進行實驗。

1.3Morris水迷宮實驗將4組大鼠于癲癇模型建立7 d后進行實驗，共持續(xù)4 d進行定位航行實驗?？臻g探索實驗：于第5天進行，撤去平臺，將大鼠于水池中任意一點放入水中游泳，記錄大鼠60 s內(nèi)穿越平臺的次數(shù)。

1.4RT-PCR法檢測大鼠海馬組織中5-HT2A受體的表達模型建立7、14、28 d后，分別將4組大鼠給予10%水合氯醛(0.1 ml/kg)麻醉后固定，斷頭取出海馬組織并立即放在液氮中保存。海馬組織勻漿后，加入Trizol液提取mRNA，按照試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將cDNA產(chǎn)物進行Real-time PCR循環(huán)。從NCBI庫中搜索到5-HT2A受體應用Premier5.0引物設計軟件設計引物。5-HT2A上游引物：5′GGTTTCCTT-GTCATGCCTGT 3′，下游：5′TGCAGGATTCTTTGCAGATG 3′；內(nèi)參GAPDH上游：5′TGCTTCACCACCTTCTTGA 3′，下游：5′TCACCATCTTCCAGGAGCG 3′。擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳。

1.5統(tǒng)計學分析采用SPSS17.0軟件進行方差分析、單因素方差分析和t檢驗。

2結(jié)果

2.1觀察大鼠行為學表現(xiàn)匹羅卡品腹腔注射約5～10 min后，Li-PILO組和Li-PILO+LEV組大鼠出現(xiàn)癲癇發(fā)作，表現(xiàn)為面部抽動、點頭、洗臉、前肢陣攣、跌倒以至全面性強直陣攣發(fā)作，其中Li-PILO組和Li-PILO+LEV組共有9只大鼠抽搐后死亡，癲癇發(fā)作30 min后立即給予地西泮(10 mg/kg)腹腔注射終止發(fā)作，在大鼠成功建立模型后Li-PILO組和Li-PILO+LEV組大鼠表現(xiàn)出易激惹，并可觀察到Ⅰ～Ⅳ級的癲癇發(fā)作。

2.2LVE對認知功能的影響在定位航行實驗中，與對照組比較，Li-PILO組的逃避潛伏期明顯延長(P<0.05)；Li-PILO組與Li-PILO+LEV組比較，Li-PILO+LEV組的逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)；LEV組和NS組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)?？臻g搜索實驗中，與對照組比較，Li-PILO組穿越平臺的次數(shù)明顯減少(P<0.05)；與Li-PILO組比較，Li-PILO+LEV組穿越平臺次數(shù)顯著增多(P<0.05)，見表1。

表1　LEV對大鼠認知功能的影響

與Li-PILO組比較：1)P<0.05

2.3各組大鼠海馬組織中5-HT2A受體的表達NS組內(nèi)各時間點5-HT2A受體表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與NS組比較，Li-PILO組在第7天時大鼠海馬組織中5-HT2A受體表達水平降低，且隨時間延長5-HT2A受體表達水平明顯降低，即在第14、28天，5-HT2A受體表達水平明顯降低(P<0.05)；與Li-PILO組比較，Li-PILO+LEV組5-HT2A受體在第7、14、28天表達水平明顯升高(P<0.05)，見表2、圖1。

表2　海馬組織中5-HT2A受體相對表達量的

與NS組比較:1)P<0.05；與Li-PILO組比較:2)P<0.05

A：Li-PILO+LEV組；B：Li-PILO組；C：NS組；D：LEV組 圖1　PCR檢測第14天各組大鼠海馬組織中5-HT2A受體表達

3討論

癲癇是小兒時期常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，其特點是自發(fā)、慢性、短暫、反復發(fā)作。癲癇可引起患兒的人格障礙、記憶力減退、智力低下等表現(xiàn)，尤其是在患兒的發(fā)育早期影響較大〔7〕。

5-羥色胺(5-HT)是一種吲哚衍生物，是重要的神經(jīng)遞質(zhì)，其主要的作用有參與記憶和學習、情緒、食欲、體溫調(diào)節(jié)、心血管功能、睡眠控制、性和致幻行為、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌和抑郁以及肌肉收縮等生理功能〔8〕。5-HT2A受體是5-HT受體的亞型之一。有研究報道5-HT2A受體與神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關，Berg等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)受損時腦組織中5-HT2A受體數(shù)目明顯減少。然而目前關于5-HT2A受體與癲癇的關系國內(nèi)外暫無報道，而關于5-HT與癲癇的關系報道很多，5-HT在含有抑制性遞質(zhì)γ氨基丁酸的神經(jīng)元上表達，從而激活γ氨基丁酸，間接地發(fā)揮其抗癲癇作用。本研究提示5-HT2A受體與癲癇有密切的關系，LVE的抗癲癇機制可能是通過升高5-HT2A的表達而發(fā)揮其抗癲癇作用。認知功能包括了學習和記憶的過程。海馬是哺乳動物學習記憶的重要腦區(qū)，其損傷會導致學習記憶的障礙。癲癇發(fā)作會損傷海馬，LEV可治療癲癇，控制癲癇發(fā)作，減少海馬損傷，改善學習記憶。LEV作為治療小兒癲癇的藥物，對認知功能無影響，是一種療效好、安全性好的廣譜抗癲癇藥。何繪敏等〔10〕在左乙拉西坦對幼年癲癇大鼠空間學習記憶的影響中發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，LEV組大鼠的逃避潛伏期明顯縮短，LEV能夠改善大鼠的學習記憶功能。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在定位航行實驗中癲癇模型組的逃避潛伏期明顯延長，以上的結(jié)果顯示LEV對癲癇大鼠的認知功能有一定的改善作用，LEV對正常大鼠空間學習記憶能力無損害作用，是安全性很好的抗癲癇藥物。

4參考文獻

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2DiIorio CK，Bamps YA，Edwards AL，etal.The prevention research centers′ managing epilepsy well network〔J〕.Epilepsy Behav，2010；19(3)：218-24.

3Nowack A，Malarkey EB，Jia Y，etal.Levetiracetam reverses synaptic deficits produced by overexpression of SV2A〔J〕.PLoS One，2011；6(12)：1-8.

4Chung S，Wang N，Hank N.Comparative retention rates and long-term tolerability of new antiepileptic drugs〔J〕.Seizure，2007；16(4)：296-304.

5Sanchez PE，Zhu L，Verret L，etal.Levetiracetam suppresses neuronal network dysfunction and reverses synaptic and cognitive deficits in an Alzheimer′s disease model〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2012；109(42)：2895-903.

6梁益，孫紅斌.氯化鋰-匹羅卡品癲癇模型研究〔J〕.實用醫(yī)學臨床雜志，2008；5(3)：112-4.

7Hermann BP，Serdenerg M，Bel B，etal.The neurodevelopmental impact of childhood onset temporal lobe epilepsy on brain structure and function〔J〕.Epilepsia，2002；43(9)：1062-71.

8Berger M，Gray JA，Roth BL.The expanded biology of serotonin〔J〕.Ann Rev Med，2009；60(1)：355-66.

9Berg KA，Harvey JA，Spampinato U，etal.Physiological and therapeutic relevance of constitutive activity of 5-HT2A and 5-HT2C receptors for the treatment of depression〔J〕.Prog Brain Res，2008；172(3)：287-305.

10何繪敏，路晴，孫香梅，等.左乙拉西坦對幼年癲癇大鼠空間學習記憶及海馬膠質(zhì)原纖維酸性蛋白的影響〔J〕.兒科藥學雜志，2011；17(4)：9-12.

〔2014-05-22修回〕

(編輯李相軍/滕欣航)