宋亞茹　李榮凱　翟成凱

[摘要] 目的 檢測抗菌肽LL-37慢性阻塞性肺疾?。–OPD）患者血清中和誘導(dǎo)痰中的表達(dá)水平及其在COPD發(fā)病中的作用。 方法 選擇27例符合標(biāo)準(zhǔn)的穩(wěn)定期COPD患者（COPD穩(wěn)定組），28例符合標(biāo)準(zhǔn)的急性加重期COPD患者（COPD急性加重組）及24例健康對(duì)照者（自2014年1～8月），應(yīng)用ELISA法檢測血清中和誘導(dǎo)痰中LL-37的含量，由定量數(shù)據(jù)分析其與FEV1%和SGRQ 分?jǐn)?shù)的直線相關(guān)關(guān)系。 結(jié)果 與健康對(duì)照組相比，COPD穩(wěn)定組和COPD急性加重組誘導(dǎo)痰中LL-37的含量均明顯升高（P<0.01），三組之間血清中LL-37的含量無明顯差異（P>0.05）。COPD穩(wěn)定組和COPD急性加重組誘導(dǎo)痰中LL-37的水平與FEV1%呈負(fù)相關(guān)（P<0.05或P<0.01），而與SGRQ 分?jǐn)?shù)正相關(guān)（P<0.05或P<0.01）。 結(jié)論 COPD患者誘導(dǎo)痰中LL-37含量升高，且其表達(dá)水平與FEV1%和SGRQ 分?jǐn)?shù)有相關(guān)性，LL-37可能在COPD的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。

[關(guān)鍵詞] 慢性阻塞性肺疾病；LL-37；圣喬治呼吸問卷分?jǐn)?shù)；炎癥

[中圖分類號(hào)] R562.25 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2015）32-0008-03

[Abstract] Objective To examine the concentrations of LL-37 in sera and induced sputum from chronic obstructive pulmonary diseases（COPD） patients and to access the role of LL-37 in the pathogenesis of COPD. Methods The LL-37 levels were determined in sera and induced sputum from twenty-seven patients with stable COPD（SCOPD group）， twenty-eight patients with acute exacerbation of COPD（AECOPD group）and twenty-four healthy controls （from Jan to Aug 2014）by ELISA， and then the linear correlations with FEV1% and SGRQ scores were analyzed using quantitative data. Results Compared with healthy control group， the levels of LL-37 in induced sputum were markedly higher in SCOPD group and AECOPD group（P<0.01）. However， the levels of LL-37 in sera were no difference among these three groups（P>0.05）. Furthermore， the LL-37 levels in induced sputum negatively correlated with FEV1% in both SCOPD group（P<0.05）and AECOPD group（P<0.01）. On the contrary，the LL-37 levels in induced sputum positively correlated with SGRQ scores in both SCOPD group（P<0.05） and AECOPD group（P<0.01）. Conclusion The expression levles of LL-37 are increased in induced sputum from COPD patients compared with healthy controls，and correlated with FEV1% and SGRQ scores in COPD patients， suggesting that LL-37 may play an important role in the pathogenesis of COPD.

[Key words] Chronic obstructive pulmonary diseases； LL-37； SGRQ scores； Inflammation

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種持續(xù)存在的以不完全可逆的氣流受限為特征的慢性呼吸道疾病，近年來的研究表明，氣道局部浸潤的固有免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞活化后釋放的炎癥介質(zhì)和蛋白酶成分在COPD的致病過程中扮演重要角色[1，2]，然而精確的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。內(nèi)源性抗菌肽是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在人類已經(jīng)鑒定出十多種抗菌肽，而防御素家族和Cathelicidins家族是機(jī)體最重要的內(nèi)源性抗菌肽。到目前為止，LL-37是Cathelicidins家族的唯一成員[3]。LL-37具有光譜抗菌活性，參與抵抗和殺傷革蘭陰性菌、革蘭陽性菌、真菌和病毒等，還可以中和革蘭陰性菌細(xì)胞壁的脂多糖內(nèi)毒素[4-5]。然而，LL-37在人類COPD患者的表達(dá)及其重要性尚不清楚。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

COPD組：病例收集自2014年1～8月在新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院呼吸科住院的COPD患者55例，其中男42例，女13例，病例入選標(biāo)準(zhǔn)均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)制定的COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。病例組又分為穩(wěn)定期27例和急性加重期28例。健康對(duì)照組：于新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院體檢中心選擇無心肺疾病，且近期無呼吸道感染史，肺功能正常的健康志愿者24例，其中男17例，女7例。所有入選者均知情并簽署知情同意書，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

肺功能測定：所有受試對(duì)象的肺功能均在同一肺功能檢測醫(yī)師指導(dǎo)下使用德國耶格肺功能儀測定，肺功能指標(biāo)包括第一秒用力呼氣容積（FEV1）占預(yù)計(jì)百分比（FEV1% pred）和第一秒用力呼氣容積占用力肺活量（FVC）的百分比（FEV1/FVC（%））等。受試對(duì)象的健康狀況使用St.George's呼吸調(diào)查表（St.George's Respiratory Questionnaire，SGRQ）評(píng)估[7，8]，SGRQ的評(píng)估分?jǐn)?shù)范圍是0～100分，分?jǐn)?shù)越低表示健康狀況越好。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 血液標(biāo)本和誘導(dǎo)痰標(biāo)本收集 所有受試對(duì)象均于清晨空腹抽取外周靜脈血5 mL，凝固離心后小心吸取上清液即血清凍存于-80℃冰箱。受試對(duì)象先吸入沙丁胺醇200 μg，20 min之后通過超聲噴霧器吸入3%高滲生理鹽水，隨即收集誘導(dǎo)出的痰液并稱重，粘液稀釋離心后吸取上清液凍存于-80℃冰箱，待檢測。

1.3.2 LL-37的測定 采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清中和誘導(dǎo)痰中LL-37的含量，嚴(yán)格按照試劑盒（上海佳和生物科技有限公司）說明書操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間均數(shù)差異采用雙側(cè)非配對(duì)t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，相關(guān)性分析采用Spearman 秩相關(guān)分析。所有分析均應(yīng)用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行，所有統(tǒng)計(jì)結(jié)論采用0.01與0.05兩概率界值。

2 結(jié)果

2.1 三組間臨床資料分析

三組研究對(duì)象的臨床資料特征見表1，與健康對(duì)照組相比，COPD穩(wěn)定組和COPD急性加重組均存在不同程度的氣流受限，肺功能檢測相關(guān)指標(biāo)FEV1%pred和FEV1/FVC差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。另外，COPD穩(wěn)定組和COPD急性加重組的吸煙指數(shù)明顯高于健康對(duì)照組（P<0.05或P<0.01），SGRQ亦明顯高于健康對(duì)照組（P<0.01）。而各組在年齡構(gòu)成方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 血清中和誘導(dǎo)痰中LL-37的表達(dá)變化

健康對(duì)照組與COPD穩(wěn)定組血清中LL-37的水平無明顯變化[（291.8±15.52）pg/mL vs （282.9±17.36）pg/mL，P>0.05]，與COPD急性加重組血清中LL-37的水平亦無明顯變化[（291.8±15.52）pg/mL vs （274.6±17.44）pg/mL，P>0.05]，見圖1。與健康對(duì)照組相比，COPD穩(wěn)定組誘導(dǎo)痰中LL-37水平明顯升高[（2.7±0.25）ng/mL vs （6.3±0.42）ng/mL，P<0.01]，COPD急性加重組誘導(dǎo)痰中LL-37的水平也顯著升高[（2.7±0.25）ng/mL vs （9.5±0.45）ng/mL，P<0.001]。急性加重組誘導(dǎo)痰中LL-37水平高于穩(wěn)定組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（9.5±0.45）ng/mL vs （6.3±0.42）ng/mL，P<0.01]，見圖2。

2.3 LL-37與FEV1%和SGRQ的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示：COPD穩(wěn)定組誘導(dǎo)痰中LL-37水平與肺功能指標(biāo)FEV1%負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=-0.432（P<0.05）；急性加重組誘導(dǎo)痰中LL-37的水平亦與肺功能指標(biāo)FEV1%負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=-0.562（P<0.01），見圖3。此外，COPD穩(wěn)定組和急性加重組誘導(dǎo)痰中LL-37的水平與SGRQ均呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為r=0.459（P<0.05）和r=0.669（P<0.001），見圖3。

3 討論

內(nèi)源性抗菌肽是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在抗感染免疫過程中發(fā)揮重要作用。LL-37首次從骨髓細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，是人類Cathelicidins家族的唯一成員[9]，LL-37分布廣泛，主要由局部固有免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和局部上皮細(xì)胞分泌釋放[2，3]。然而LL-37在人類COPD患者中的表達(dá)及重要性尚未研究。在本項(xiàng)研究中，為探討LL-37在COPD致病過程中的可能作用，我們首先檢測LL-37在COPD患者血清中和誘導(dǎo)痰中的表達(dá)水平，接著分析LL-37的表達(dá)水平與肺功能相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性。

COPD穩(wěn)定組和COPD急性加重組誘導(dǎo)痰中LL-37的水平與健康對(duì)照組相比顯著升高，并且COPD急性加重組高于COPD穩(wěn)定組，造成這種差異的原因可能是氣道炎癥應(yīng)答的不同狀態(tài)所致。一般情況下，急性加重期同時(shí)伴有流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌感染，相對(duì)于穩(wěn)定期，這種感染會(huì)進(jìn)一步誘發(fā)局部炎癥應(yīng)答，LL-37水平分泌增加可能做為一種反饋機(jī)制抑制此種炎癥應(yīng)答。免疫組化結(jié)果顯示LL-37主要表達(dá)于支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、肺部浸潤的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等炎細(xì)胞[10]，推測這些細(xì)胞是導(dǎo)致LL-37水平升高的重要來源。COPD患者誘導(dǎo)痰中LL-37的異常升高不僅僅是局部免疫細(xì)胞浸潤數(shù)量的增加導(dǎo)致，而是于炎癥環(huán)境中多種細(xì)胞共同參與交互作用調(diào)節(jié)的結(jié)果。我們進(jìn)一步分析了LL-37與肺功能指標(biāo)FEV1%和SGRQ的相關(guān)性，重要的是，發(fā)現(xiàn)LL-37的水平與FEV1%存在明顯的負(fù)相關(guān)，提示LL-37的表達(dá)水平可以在一定程度上預(yù)測肺功能的狀況。此外，LL-37的水平與SGRQ存在明顯的正相關(guān)，我們建議采用LL-37和SGRQ雙重指標(biāo)可能更能反映COPD的疾病嚴(yán)重程度。

總之，這些研究結(jié)果提示LL-37可能在COPD的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，LL-37發(fā)揮作用的機(jī)制以及能否用于臨床診斷和治療COPD有待于進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Barnes PJ，Shapiro SD，Pauwels RA. Chronic obstructive pulmonary disease： Molecular and cellular mechanisms[J]. Eur Respir J，2003，22（4）：672-688.

[2] Shaw JG，Vaughan A，Dent AG，et al. Biomarkers of progression of chronic obstructive pulmonary disease（COPD）[J].J Thorac Dis，2014，6（11）：1532-1547.

[3] Bals R，Wang X，Zasloff M，et al. The peptide antibiotic LL-37/hCAP-18 is expressed in epithelia of the human lung where it has broad antimicrobial activity at the airway surface[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（16）：9541-9546.

[4] Nagaoka I，Hirota S，Niyonsaba F，et al. Cathelicidin family of antibacterial peptides CAP18 and CAP11 inhibit the expression of TNF-alpha by blocking the binding of LPS to CD14（t）cells[J]. J Immunol，2001，167（6）：3329-3338.

[5] Velarde JJ，Ashbaugh M，Wessels MR. The human antimicrobial peptide LL-37 binds directly to CsrS，a sensor histidine kinase of group A Streptococcus，to activate expression of virulence factors[J]. J Biol Chem，2014，289（52）：36315-36324.

[6] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)慢性阻塞性肺疾病學(xué)組. 慢性阻塞性肺疾病診治指南（2007年修訂版）[J]. 中華結(jié)核和呼吸雜志，2007，30（1）：8-17.

[7] Mohktar MS，Redmond SJ，Antoniades NC，et al. Predicting the risk of exacerbation in patients with chronic obstructive pulmonary disease using home telehealth measurement data[J]. Artif Intell Med，2015，63（1）：51-59.

[8] Jones PW. Health status measurement in chronic obstructive pulmonary disease[J]. Thorax，2001，56（11）：880-887.

[9] Larrick JW，Hirata M，Balint RF，et al. Human CAP18：a novel antimicrobial lipopolysaccharidebinding protein. Infect Immun，1995，63（4）：1291-1297.

[10] Zhang Y，Shi W，Tang S，et al. The influence of cathelicidin LL37 in human anti-neutrophils cytoplasmic antibody（ANCA）-associated vasculitis[J]. Arthritis Res Ther，2013，15（5）：R161.

（收稿日期：2015-08-31）