，，，，，，*

(1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科 湖南 衡陽(yáng) 421001;2.廣東省第二人民醫(yī)院藥物臨床試驗(yàn)基地;3.南華大學(xué) 湖南省分子靶標(biāo)新藥研究協(xié)同創(chuàng)新中心)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

CGRP通過(guò)抑制p38MAPK/ NOX4通路保護(hù)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷

歐奇林1，曾泗宇2，駱競(jìng)妃3，彭虹艷3，洪陳亮3，曾高峰1，秦旭平3*

(1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科 湖南 衡陽(yáng) 421001;2.廣東省第二人民醫(yī)院藥物臨床試驗(yàn)基地;3.南華大學(xué) 湖南省分子靶標(biāo)新藥研究協(xié)同創(chuàng)新中心)

目的觀察降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)對(duì)氧化應(yīng)激損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及其對(duì)p38 MAPK/NOX4信號(hào)通路的抑制作用。方法體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVECs)，外源性給予過(guò)氧化氫(H2O2)或血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)作為氧化刺激因素，CGRP作為保護(hù)劑處理細(xì)胞。噻唑藍(lán)比色法(MTT)觀察HUVECs活力；流式細(xì)胞儀(FCM)觀察分析HUVECs增殖指數(shù)的改變； Western Blot和Real-time PCR分別檢測(cè)p38 MAPK、NADPH氧化酶4 (NOX4)蛋白和mRNA的表達(dá)。結(jié)果500 μmol/L H2O2或100 nmol/L AngⅡ能濃度依賴(lài)性地降低HUVECs活力和增殖指數(shù)(PI)；CGRP可以顯著增加HUVECs活力和及其PI。同時(shí)，H2O2、AngⅡ均能誘導(dǎo)p38 MAPK磷酸化，并能上調(diào)NOX4蛋白和mRNA表達(dá)，p38 MAPK阻斷劑能部分增強(qiáng)CGRP抑制AngⅡ或H2O2誘導(dǎo)的NOX4的表達(dá)。結(jié)論CGRP對(duì)內(nèi)外源性的氧化應(yīng)激損傷HUVECs的保護(hù)機(jī)制可能與抑制p38 MAPK/NOX4信號(hào)通路有關(guān)。

降鈣素基因相關(guān)肽； 氧化應(yīng)激； 內(nèi)皮細(xì)胞； NADPH氧化酶4

血管內(nèi)皮損傷及其功能紊亂是引起心血管疾病發(fā)生發(fā)展的起始事件[1]。探討內(nèi)皮損傷的病理過(guò)程對(duì)治療各種心血管疾病具有重要意義?；钚匝?ROS)主要包括羥基自由基(-OH)、過(guò)氧化氫(H2O2)、超氧陰離子(-O2-)、單線(xiàn)態(tài)氧(1O2)等。近年研究表明ROS在內(nèi)皮損傷中的作用不容忽視。多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子，如血管緊張素Ⅱ (AngⅡ)[2]，血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)[3]能通過(guò)激發(fā)內(nèi)源性的ROS損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞。研究明確煙酞胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶，簡(jiǎn)稱(chēng)NADPH氧化酶(NADPH oxidase，Nox)是血管內(nèi)生成ROS的主要酶體[4]。有證據(jù)證明，NOX4在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于其它Nox成員，研究數(shù)據(jù)證實(shí)NOX4對(duì)內(nèi)皮氧化還原反應(yīng)發(fā)揮關(guān)鍵作用，并對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生理有重要的功能性調(diào)節(jié)作用[5]。降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)是目前已知的最強(qiáng)舒張血管的神經(jīng)多肽，其舒張血管作用與保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能相關(guān)[6]。本研究擬證明，CGRP通過(guò)對(duì)抗內(nèi)外源性氧化應(yīng)激保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能的機(jī)制，為闡明CGRP的生理功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要材料與試劑人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株 (HUVECs)(Catalog Number:C-003-5C) 購(gòu)自上海拜力生物技術(shù)公司。CGRP、AngⅡ(Sigma公司)、β-actin多克隆抗體(長(zhǎng)沙艾杰生物技術(shù)有限公司)、NOX4多克隆一抗(Santa Cruze公司)，P38 MAPK/P-p38 MAPK兔源單克隆抗體(cell signaling technology公司)；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔或二抗(Santa Cruze公司)；Real-time quantative PCR試劑盒(廣州東盛生物技術(shù)有限公司)；優(yōu)質(zhì)胎牛血清(杭州四季青公司)。

1.2 HUVECs培養(yǎng)HUVEC接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和10 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%的CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞用0.25%的胰酶消化傳代，取長(zhǎng)勢(shì)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞的活力將HUVECs在DMEM培養(yǎng)基制成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔2×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，并放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)到50%融合時(shí)更換含0.1%血清的DMEM培養(yǎng)基(每孔180 μL)同步化24 h，之后分別按實(shí)驗(yàn)要求分組處理。①對(duì)照組(0.1%血清的DMEM培養(yǎng))，實(shí)驗(yàn)組在此基礎(chǔ)上分別加入H2O2、AngⅡ或 CGRP處理；觀察CGRP保護(hù)作用時(shí)，CGRP預(yù)處理30 min后再加 H2O2或AngⅡ處理24 h。隨后在培養(yǎng)板中加入10× MTT 20 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基，加入200 μLDMSO，37 ℃孵育10 min，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定在波長(zhǎng)為570 nm時(shí)的光密度值(OD570)。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和增殖將100 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的HUVEC用含0.1%血清的DMEM培養(yǎng)基同步化24 h，后按要求(見(jiàn)方法1.3)處理細(xì)胞。隨后收集細(xì)胞，PBS清洗一遍，棄上清，每組用1 mL 75%乙醇固定。樣品寄至北京中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院基礎(chǔ)理論研究所檢測(cè)。

1.5 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)按實(shí)驗(yàn)要求(見(jiàn)方法1.3)處理細(xì)胞，按照細(xì)胞漿/核/膜/結(jié)構(gòu)蛋白抽屜試劑盒步驟提取細(xì)胞蛋白。按照BCA試劑盒說(shuō)明用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)OD570計(jì)算蛋白含量。將提取的細(xì)胞總蛋白的上樣緩沖液100 ℃煮5 min后冰浴，配制10%分離膠和5%積層膠，灌1.5 mm板，100 V電壓跑過(guò)積層膠后，換160 V電壓跑分離膠，將電泳總時(shí)間控制在90 min之內(nèi)。然后轉(zhuǎn)膜、麗春紅染色觀察蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移情況。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，1∶1000加入p38 MAPK、NOX4和β-actin等一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌15 min，每5 min換液1次。1 ∶2 000加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗，37 ℃孵育45 min，TBST洗滌45 min，每15 min換液1次。然后在暗室中滴加化學(xué)發(fā)光試劑激發(fā)熒光，壓片，然后顯影、定影。圖片用AlphaImager2200進(jìn)行灰度掃描。

1.6 RT-PCR檢測(cè)NOX4 mRNA表達(dá)NOX4和GAPDH引物由艾杰生物公司設(shè)計(jì)，并由北京三博遠(yuǎn)志生物公司合成。NOX4正義鏈：AACTTATGTTCCCTGGCTATC，反義鏈：TCTTGAACTCTGACCTCGT；GAPDH正義鏈：CTGCACCACCAACTGCTTAG，反義鏈：AGGTCCACCACTGACACGTT。

細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)要求處理后，提取總RNA并合成cDNA。-20 ℃長(zhǎng)期保存。在八聯(lián)管中依次加入：第一鏈cDNA1μL、引物2 μL，2×SYBR Green qPCR Mix 15 μL，ddH2O補(bǔ)至25 μL。熒光PCR儀上按以下步驟進(jìn)行：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s、NOX4和GAPDH 50 ℃退火延伸共1 min,40個(gè)循環(huán)。最后72 ℃終延伸10 min。55 ℃到95 ℃之間每0.5 ℃為一個(gè)梯度，每個(gè)梯度延續(xù)10 s，測(cè)定引物的融解曲線(xiàn)。統(tǒng)計(jì)Ct值，根據(jù)2-ΔΔCt法表示相對(duì)定量結(jié)果。以GAPDH作為內(nèi)參，根據(jù)公式ΔCt=[Ct(NOX4)]-[Ct(GAPDH)]、ΔΔCt=[ΔCt(實(shí)驗(yàn)組)-ΔCt(對(duì)照組)]，2-ΔΔCt表示實(shí)驗(yàn)組NOX4相對(duì)于對(duì)照組原始拷貝數(shù)的倍數(shù)差異。

2 結(jié) 果

2.1 CGRP逆轉(zhuǎn)Ang Ⅱ或H2O2對(duì)HUVECs生長(zhǎng)的抑制作用根據(jù)本組前期研究結(jié)果和本次結(jié)果可以看出，CGRP能劑量依賴(lài)性增加HUVECs活力(圖1A)，Ang Ⅱ或H2O2劑量依賴(lài)性地降低HUVECs活力(圖1B，1C)。按照保護(hù)或損傷有明細(xì)差異的原則，我們選擇處理細(xì)胞的劑量分別是： CGRP 100 nmol/L、H2O2500 μmol/L、Ang Ⅱ 100 nmol/L；給予CGRP分別預(yù)處理HUVEC 30 min，如圖1D所示，CGRP能使Ang Ⅱ 或H2O2損傷的HUVEC活力增加，說(shuō)明CGRP具有明顯的抗氧化作用。另外，從流式細(xì)胞儀結(jié)果(表1)看，CGRP具有明顯的促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并對(duì)抗Ang Ⅱ 或H2O2對(duì)HUVECs的抑制增殖或損傷作用。

圖1 CGRP對(duì)Ang Ⅱ或H2O2 抑制HUVECs生長(zhǎng)作用的影響 A、B、C 分別為 CGRP 、H2O2、Ang Ⅱ?qū)?xì)胞作用的量—效關(guān)系，D:CGRP(100 nmol/L) 預(yù)處理對(duì)Ang Ⅱ(100 nmol/L)或H2O2(500 μmol/L)損傷細(xì)胞的保護(hù)作用。與對(duì)照組(Control)比較，*:P<0.05，**:P<0.01；與AngⅡ比較，#:P<0.05；與 H2O2比較 +:P<0.05，(n=3)

2.2 H2O2，Ang Ⅱ通過(guò)P38 MAPK磷酸化誘導(dǎo)NOX4表達(dá)為了觀察Ang Ⅱ 或H2O2對(duì)氧化應(yīng)激p38 MAPK信號(hào)通路的影響，用Ang Ⅱ (100 nmol/L) 或500 μmol/L H2O2以及SB 203580 (p38 MAPK磷酸化抑制劑)分別處理HUVECs 10 min，觀察p38 MAPK磷酸化水平的變化。如圖2所示，Ang Ⅱ 或H2O2能顯著增加磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)表達(dá)(A)和NOX4的蛋白表達(dá)(B)水平，給予SB 203580后，p-p38 MAPK表達(dá)顯著降低，同時(shí)，也降低了NOX4的蛋白表達(dá)。說(shuō)明內(nèi)源性(Ang Ⅱ)和外源性(H2O2)氧化應(yīng)激均通過(guò)p38 MAPK信號(hào)通路發(fā)生作用。

2.3 CGRP對(duì)Ang Ⅱ (A)或H2O2對(duì)NOX4表達(dá)的影響如圖3所示，與對(duì)照組相比，單獨(dú)CGRPG1/G0：停留于G1/G0期(無(wú)增殖活動(dòng)期)細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)；S：DNA合成期細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)；G2：DNA合成后期細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)；M：DNA分裂細(xì)胞的百分?jǐn)?shù).PI=(S+G2M)/(G1G0+S+G2M),與對(duì)照組(Control)a:P<0.01;與Ang Ⅱ 或H2O2比較，b:P<0.05

表1CGRP對(duì)ANGⅡ或H2O2引起的HUVECs周期分布的影響

組別G1/G0%S%G2/M%PI值%Control44.8±0.3543.9±0.2711.3±0.1155.2±0.35AngⅡ50.5±0.1542.6±0.427.1±0.4649.6±0.21aH2O251.0±2.640.6±2.2a8.4±0.846.8±0.45aCGRP+AngⅡ41.0±0.6147.6±0.83b11.4±0.3159.0±0.60bGRP+H2O240.8±4.245.6±4.1b10.0±1.261.1±1.3b

圖2 抑制 p38MAPK磷酸化對(duì)AngⅡ或H2O2 誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)NOX4表達(dá)的影響 A：p38MAPK磷酸化蛋白表達(dá)，B:NOX4蛋白表達(dá)；SB:SB 203580(p38 MAPK磷酸化抑制劑)；與對(duì)照組(Control)比較，*:P<0.05，與AngⅡ比較，#:P<0.01，與H2O2比較，+:P<0.01(n=3)

能明顯降低NOX4蛋白(圖3A)和mRNA(圖3B)的表達(dá)，p38 MAPK磷酸化抑制劑SB203580能取消CGRP這種抑制作用，說(shuō)明CGRP是通過(guò)p38 MAPK磷酸化誘導(dǎo)NOX4表達(dá)增加；給細(xì)胞預(yù)孵育CGRP 30 min,再給予Ang Ⅱ 或H2O2共培養(yǎng)細(xì)胞24 h。 與比對(duì)照組相比，NOX4表達(dá)并沒(méi)有增加，且略有降低，結(jié)合圖2B中Ang Ⅱ 及H2O2單獨(dú)應(yīng)用的結(jié)果，說(shuō)明CGRP對(duì)Ang Ⅱ 或H2O2誘導(dǎo)的NOX4表達(dá)增加有抑制作用； CGRP加p38 MAPK磷酸化抑制劑SB203580共預(yù)孵育細(xì)胞30 min，并能進(jìn)一步降低CGRP對(duì)Ang Ⅱ 或H2O2誘導(dǎo)的NOX4表達(dá)能力。說(shuō)明CGRP對(duì)Ang Ⅱ 或H2O2誘導(dǎo)的NOX4表達(dá)的抑制作用可能部分通過(guò)p38 MAPK信號(hào)途徑。

圖3 CGRP對(duì)AngⅡ或H2O2誘導(dǎo)的NOX4表達(dá)影響 A:蛋白質(zhì)表達(dá)；B：mRNA表達(dá)(n=3)，SB:SB 203580是p38 MAPK磷酸化抑制劑；與對(duì)照組(Control)比較，*：P<0.05，與CGRP比較，#:P<0.05；與CGRP+Ang Ⅱ比較，+:P<0.01；與CGRP+H2O2比較，$:P<0.05(n=3)

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是外源性H2O2還是AngⅡ內(nèi)源性刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞可能通過(guò)激活p38 MAPK磷酸化導(dǎo)致內(nèi)源性氧化應(yīng)激增加NOX4表達(dá)，導(dǎo)致內(nèi)源性ROS增加并引起HUVEC損傷；CGRP保護(hù)HUVEC的機(jī)制可能與通過(guò)抑制p38 MAPK磷酸化水平、下調(diào)NOX4表達(dá)有關(guān)。

研究顯示，MAPK家族中的p38 MAPK信號(hào)通路主要介導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，H2O2和AngⅡ能顯著升高磷酸化p38 MAPK及NOX4表達(dá)水平，可能是由于過(guò)多的AngⅡ和H2O2處理內(nèi)皮細(xì)胞后引發(fā)p38 MAPK磷酸化使內(nèi)源性ROS濃度升高，進(jìn)而引起細(xì)胞損傷，降低內(nèi)皮細(xì)胞增殖，甚至是細(xì)胞凋亡。100nmol/LCGRP干預(yù)后，能明顯下調(diào)H2O2和AngⅡ引起的磷酸化p38 MAPK水平，且給予p38 MAPK磷酸化抑制劑SB203580能抑制H2O2和AngⅡ誘導(dǎo)的NOX4蛋白和mRNA的表達(dá)，提示CGRP可能不是直接作用于NOX4，而可能通過(guò)抑制p38 MAPK磷酸化進(jìn)而抑制NOX4表達(dá)。

總之，本實(shí)驗(yàn)證明，在H2O2和AngⅡ誘導(dǎo)的HUVEC損傷過(guò)程中，NOX4呈激活狀態(tài)，說(shuō)明NOX4與HUVEC損傷密切相關(guān)，CGRP對(duì)HUVECs的保護(hù)作用也可能與下調(diào)p38 MAPK磷酸化和進(jìn)而抑制NOX4表達(dá)有關(guān)。

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Inhibitionofp38MAPK/NOX4SignalPathwayMediatestheProtectionofCGRPontheHUVECsInjuredbyOxidativeStress

OU Qilin,ZENG Siyu,LUO Jingfei,et al

(DepartmentofCardioMedicine,TheSecondAffiliatedHosptial，UniversityofSouthChina,Hengyang421001,Hunan,China)

ObjectiveTo study the protection of cacitonin gene-related peptide (CGRP) on human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) injured by oxidative stress,and explore whether the mechanism involved in inhibition of p38MAPK/ NOX4 signal pathway.MethodsHUVECs cell line were cultured in vitro,angiotensin Ⅱ (AngⅡ) or hydrogen peroxide (H2O2) serves as the gent of oxidative stress,CGRP serves as the protection agent.MTT was used to test the viability of cells,distribution of cell cycles and proliferation of cells were observed by flow cytometry.The protein or mRNA expressions of the p38 MAPK、NADPH oxidase 4 (NOX4) was measured by Western blot or RT-PCR,respectively.RethodsCompared with control group,AngⅡ or H2O2decreased the cell viability and proliferation index (PI)dose-dependently，which were inhibited by 100 nmol/L CGRP;Meantime,the level of phosphated p38 MAPK was induced by AngⅡ or H2O2,and increased the expression of NOX4.Pretreatment with CGRP and SB 203580 can inhibit the up-regulation of NOX4 induced by AngⅡ or H2O2.ConclusionsThe protection of CGRP on the HUVECs injured by oxidative stress from in vitro(H2O2) or in vivo(AngⅡ) is related to inhibition of p38MAPK/ NOX4 signal pathway.

CGRP; oxidative stress; endothelial cell; NADPH Oxidase4

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.04.004

2015-05-08；

2015-06-07

廣東省醫(yī)學(xué)基金，A2014159；分子靶標(biāo)新藥研究協(xié)同創(chuàng)新中心湘教通(2014)405號(hào).

*通訊作者，E-mail:qinxuping@sohu.com.

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A

(此文編輯：秦旭平)