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(1.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院2009級臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)臨改1班，湖南 衡陽 421001；2.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

胃癌中葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78的表達(dá)及其臨床病理學(xué)意義

賀正希1，唐慧嵐1，陳景飛1，陳文琳1，蔣煒崢1，謝遠(yuǎn)杰2*

(1.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院2009級臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)臨改1班，湖南 衡陽 421001；2.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室)

目的檢測葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)在胃癌組織中的表達(dá)，分析其臨床病理學(xué)意義，探討GRP78在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。方法收集48例不同臨床分期及不同分化程度胃腺癌及28例癌旁正常胃黏膜組織標(biāo)本，分別應(yīng)用RT-PCR、Western Blotting和免疫組化檢測GRP78 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。結(jié)果與正常胃黏膜組織相比，胃癌組織中GRP78 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)。免疫組化檢測GRP78陽性表達(dá)定位于胞漿，在正常胃粘膜組織中GRP78陽性表達(dá)率為10.7%(3/28)，高、中分化與低分化胃癌組織陽性表達(dá)率分別為59.4%(19/32)和93.8%(15/16)；直徑≥5 cm的胃癌組織中GRP78陽性表達(dá)率(88.9%,16/18)高于直徑<5 cm的胃癌組織(60%，18/30)，Ⅲ、Ⅳ期(TNM分期)病例胃癌組織中GRP78陽性表達(dá)率(90.5%，19/21)高于Ⅰ、Ⅱ期病例(55.6%，15/27)；5年內(nèi)病情復(fù)發(fā)或者死亡病例胃癌組織中GRP78陽性表達(dá)率(82.8%，24/29)高于5年內(nèi)病情無復(fù)發(fā)病例(52.6%，10/19)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織中GRP78陽性表達(dá)率(96.2%，25/26)明顯高于非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織(40.9%，9/22)，各組間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論GRP78在胃癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)水平與胃癌腫瘤大小、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及預(yù)后密切相關(guān)。

胃癌； 葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78； 分化； 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移； 臨床分期

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(Glucose regulatory protein 78 KD,GRP78)是葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白家族的重要成員，又稱為免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白，它作為一種分子伴侶參與蛋白質(zhì)的折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)，是正常狀態(tài)下促進(jìn)蛋白質(zhì)成熟、調(diào)節(jié)細(xì)胞機(jī)能的重要物質(zhì)。細(xì)胞在低氧等條件下發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，誘導(dǎo)GRP78大量表達(dá)，因此GRP78蛋白成為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志性蛋白質(zhì)。近來研究發(fā)現(xiàn)在肝癌[1]、胃癌[2]、乳腺癌[3]等多種腫瘤細(xì)胞中GRP78表達(dá)增高，表明GRP78的表達(dá)可能與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，但具體作用機(jī)制尚未闡明，而且目前關(guān)于GRP78在胃癌組織中表達(dá)的臨床病理意義存在分歧[4-6]。本研究通過RT-PCR、免疫組化和Western blotting等方法分別檢測GRP78 mRNA和蛋白質(zhì)在胃癌組織中的表達(dá)，分析其臨床病理學(xué)意義，初步探討GRP78表達(dá)與胃癌的關(guān)系，為進(jìn)一步研究GRP78在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本和主要試劑

收集2011年10月～2013年10月南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院行胃癌根治術(shù)后并建立電話隨訪的48例病例標(biāo)本(一般病理特征見表1)，癌旁正常胃黏膜組織28例(癌旁5 cm以上)，其中高、中分化胃癌32例，低分化胃癌16例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織26例。手術(shù)標(biāo)本取材后立即放入液氮罐保存，每例組織標(biāo)本各取一部分經(jīng)甲醛固定，制成石蠟切片，組織標(biāo)本其余部分分別用于提取蛋白質(zhì)和RNA。所有病例均經(jīng)過病理學(xué)診斷證實，且術(shù)前均未接受放化療。蛋白裂解液、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒、蛋白marker、SP免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。一步法RT-PCR試劑盒和DNA marker購自碧云天生物技術(shù)公司。PVDF膜購自Millipore，GRP78兔抗人多克隆抗體、兔抗人β-actin單抗購自博士德生物技術(shù)公司；DEPC水和Trizol購自Invitrogen，GRP78、β-actin引物由上海華美生物工程公司合成。

1.2 RT-PCR檢測胃癌組織中GRP78 mRNA的表達(dá)

取保存在液氮中各組胃組織標(biāo)本，每例100 mg，采用Trizol-氯仿抽提總RNA，按RT-PCR試劑盒(Takara公司)說明合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，GRP78 Primer:fwd(5′-GCACCACCTACTCGTGCGTT-3′)rev(5′-ACCCAGGTGAGTATCTCCGTTAG-3′)，擴(kuò)增片段長度為656 bp，PCR反應(yīng)條件是：94 ℃ 4 min；94 ℃變性30 s,58 ℃退火60 s,70 ℃延伸2 min，36個循環(huán)；70 ℃延伸6 min。β-actin Primer:fwd(5′-TGAGACCTTCAACACGCCG-3′) rev (5′-ATGGTGATGACCTGCCCGTC-3′)，擴(kuò)增片段長度為378 bp，PCR反應(yīng)條件是：94 ℃ 4 min；94 ℃變性45 s,56 ℃退火60 s,72 ℃延伸1.5 min，36個循環(huán)；72 ℃延伸8 min。反應(yīng)后各取終產(chǎn)物10 μL經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察、分析實驗結(jié)果，分別測出各組胃組織中GRP78及β-actin的積分吸光度(A)值，計算兩者的比值，以此比值作為各組胃組織中GRP78 mRNA的相對表達(dá)量。

1.3 Western blotting檢測胃癌組織中GRP78蛋白的表達(dá)

提取各組胃組織標(biāo)本的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，樣品和上樣緩沖液以4∶1混合，SDS-PAGE電泳后，經(jīng)半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)到PVDF膜上，脫脂奶粉封閉1 h，分別加入GRP78兔抗人多克隆抗體(1∶300)和β-actin抗體(1∶1 000)，37 ℃孵育2 h，HRP標(biāo)記Ⅱ抗孵育1 h，TBST洗脫3次，ECL化學(xué)發(fā)光顯影，采用Quantity One軟件測定各條帶的吸光度值，分別以各條帶與β-actin(內(nèi)參照)吸光度的比值表示各組GRP78蛋白的相對含量。

1.4 SP免疫組化檢測胃癌組織中GRP78蛋白的表達(dá)

石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，免疫組化操作步驟按試劑盒說明進(jìn)行。3%H2O2孵育10 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，10%枸櫞酸鹽緩沖液熱修復(fù)抗原，PBS洗后正常羊血清封閉30 min，滴加1∶80 GRP78兔抗人多克隆抗體，4 ℃孵育過夜，PBS清洗3 min×3次，滴加生物素化的羊抗兔Ⅱ抗，37 ℃孵育30 min，PBS清洗5 min×3次，經(jīng)DAB顯色，鏡下控制顯色時間，蘇木精復(fù)染，脫水，中性樹膠封片，陰性對照以PBS代替I抗，每張切片至少隨機(jī)觀察5個高倍視野，按照陽性細(xì)胞所占比例記分:≤5%為0分；6%～24%為1分；25%～50%為2分；>50%為3分。同時根據(jù)染色強(qiáng)度記分為:無黃色為0分；淡黃色為1分；黃色或深黃色為2分；褐色或深褐色為3分。兩項指標(biāo)的積分相加結(jié)果:≤1分為陰性，>2分為陽性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理各組數(shù)據(jù)。計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組數(shù)據(jù)間的比較行單因素方差分析，計數(shù)資料用百分比(%)表示，樣本率的比較行χ2檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 胃癌組織中GRP78 mRNA及其蛋白的表達(dá)

RT-PCR檢測結(jié)果顯示(圖1)，正常胃黏膜組織中GRP78 mRNA相對表達(dá)量(0.10±0.02)明顯低于胃癌組織(0.97±0.10，P<0.05)。Western Blotting 檢測結(jié)果顯示(圖2)，GRP78蛋白在正常胃黏膜組織中相對含量(0.13±0.03)明顯低于胃癌組織(0.87±0.08)，差異有顯著性(P<0.05)。

圖1 RT-PCR檢測胃組織中GRP78 mRNA表達(dá)水平 T:正常胃組織；N：胃癌組織 M:DNA marker;與正常組織比較，*P<0.05

圖2 Western blotting 檢測胃組織中GRP78蛋白表達(dá)水平 T:正常胃組織；N：胃癌組織；與正常組比較，*P<0.05

2.2 胃癌組織GRP78蛋白的免疫組化表達(dá)

GRP78陽性染色為棕黃色，位于胞漿(圖3)。在正常胃粘膜組織中的陽性表達(dá)率10.7%(3/28)，高、中分化與低分化胃癌組織陽性表達(dá)率分別為59.4%(19/32)和93.8%(15/16)；在直徑≥5 cm的胃癌組織中GRP78陽性表達(dá)率(88.9%,16/18)高于直徑<5cm的胃癌組織(60%,18/30)，TNM分期Ⅲ、Ⅳ期病例胃癌組織中GRP78陽性表達(dá)率(90.5%,19/21)高于Ⅰ、Ⅱ期病例(55.6%,15/27)；5年內(nèi)病情復(fù)發(fā)或者死亡病例胃癌組織中GRP78陽性表達(dá)率(82.8%,24/29)高于5年內(nèi)病情無復(fù)發(fā)病例(52.6%,10/19)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織中GRP78陽性表達(dá)率96.2%(25/26)明顯高于非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織40.9%(9/22)，各組間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。胃癌組織中GRP78蛋白表達(dá)情況分析見表1。

圖3 免疫組化SP法檢測GRP78在胃組織中的表達(dá) A：正常胃組織；B：高分化胃癌組織；C：中分化胃癌組織；D：低分化胃癌組織 AL、BL、CL、DL(400×)：分別為A、B、C、D(200×)的局部放大

3 討 論

胃癌的發(fā)生、發(fā)展是遺傳、環(huán)境、飲食及幽門螺桿菌(HP)感染等多因素共同作用的結(jié)果，但胃癌發(fā)生、發(fā)展的具體分子機(jī)制仍未明確[7]。腫瘤從根本上說屬于基因病，探討相關(guān)基因及其蛋白質(zhì)在胃癌組織中的表達(dá)，分析其臨床病理學(xué)意義，不僅為進(jìn)一步研究相關(guān)基因在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用提供實驗基礎(chǔ)，同時也有助于揭示胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制。

近期研究表明，GRP78在人類多種腫瘤組織中高表達(dá)，而且其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移能力及細(xì)胞凋亡有關(guān)，抑制ERK通路能阻斷GRP78上調(diào)表達(dá)，從而促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡[8]。GRP78的高表達(dá)與腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞的耐藥有關(guān)[9]，并且對血管生成也有一定的促進(jìn)作用[10]。雖然目前關(guān)于GRP78是通過何種機(jī)制參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展尚未完全明確，但其在多種腫瘤的高表達(dá)足以說明GRP78蛋白在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色。因此，GRP78蛋白可能成為判斷腫瘤細(xì)胞分化程度和臨床分期的有價值的分子標(biāo)記物[11]。

表1胃癌組織中GRP78蛋白表達(dá)與臨床病理特征分析

項目nGRP78陽性例數(shù)GRP78陰性例數(shù)χ2值P值性別 男37289 女11651.8320.176年齡(歲) <6023167 ≥60251870.0340.853腫瘤直徑(cm) <5301812 ≥5181624.5450.033分化程度 高、中分化321913 低分化161516.1010.014淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無22913 有2625117.6040.000TNM分期 Ⅰ～Ⅱ271512 Ⅲ～Ⅳ211926.9720.0085年內(nèi)病情進(jìn)展 無復(fù)發(fā)19109 復(fù)發(fā)或死亡292455.0430.025

多篇文獻(xiàn)報道表明，在胃癌組織中GRP78表達(dá)明顯高于正常胃黏膜組織[4-6,12-13]，但目前關(guān)于GRP78在胃癌組織中表達(dá)的臨床病理意義存在分歧，姚元春等[4]認(rèn)為GRP78高表達(dá)與胃癌腫瘤的大小、浸潤、轉(zhuǎn)移、分期有關(guān)，但與胃癌的分化程度無關(guān)，而余先祥等[5]認(rèn)為GRP78高表達(dá)僅與胃癌的分化程度有密切關(guān)系，而與胃癌腫瘤的大小、浸潤、轉(zhuǎn)移等無關(guān)。本實驗研究結(jié)果顯示，GRP78在胃癌手術(shù)標(biāo)本中的表達(dá)顯著高于正常組織，男性胃癌患者GRP78蛋白表達(dá)陽性率稍高于女性，<60歲胃癌患者稍高于≥60歲患者，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明GRP78蛋白表達(dá)與胃癌患者年齡及性別無關(guān)。但本實驗研究結(jié)果還顯示，不同分化程度的胃癌組織中GRP78表達(dá)的水平不同，低分化胃癌組織中GRP78表達(dá)陽性率明顯高于中、高分化胃癌，且低分化癌多呈強(qiáng)陽性表達(dá)，而在高、中分化癌中多呈弱陽性或陽性表達(dá)(圖3)。腫瘤直徑≥5 cm的胃癌組織中GRP78蛋白質(zhì)表達(dá)陽性率明顯高于腫瘤直徑<5 cm的胃癌組織，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織中GRP78表達(dá)陽性率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織，Ⅲ、Ⅳ期患者胃癌組織中GRP78表達(dá)陽性率明顯高于Ⅰ、Ⅱ期患者，表明GRP78蛋白質(zhì)表達(dá)不僅與胃癌細(xì)胞分化程度有關(guān)，而且與腫瘤體積大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期密切相關(guān)。組織缺氧容易導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，誘導(dǎo)GRP78的產(chǎn)生。由于腫瘤組織內(nèi)本身存在缺氧、低糖的狀況，而隨著胃癌細(xì)胞惡性生長，腫瘤體積越大，腫瘤組織內(nèi)缺氧、應(yīng)激更明顯，從而導(dǎo)致GRP78表達(dá)越高。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織中GRP78表達(dá)陽性率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織，提示GRP78可能具有促進(jìn)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的作用，然而關(guān)于GRP78促進(jìn)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚未明確。由于臨床分期與胃癌腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因此不難理解Ⅲ、Ⅳ期患者胃癌組織中GRP78表達(dá)陽性率明顯高于Ⅰ、Ⅱ期患者。本研究顯示，根治術(shù)后5年內(nèi)無復(fù)發(fā)的患者胃癌組織中GRP78表達(dá)陽性率明顯低于5年內(nèi)復(fù)發(fā)或死亡的患者，表明GRP78蛋白質(zhì)表達(dá)與患者預(yù)后密切相關(guān)。進(jìn)一步研究GRP78蛋白在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機(jī)制，有助于揭示胃癌發(fā)病的分子機(jī)制，為抑制GRP78基因表達(dá)作為胃癌防治的新靶點(diǎn)提供實驗依據(jù)。

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TheExpressionandClinicalPathologicalSignificancesofGRP78inHumanGastricCancerTissues

HE Zhengxi,TANG Huilan,CHEN Jingfei,et al

(ClassOneforClinicalMedicalReforminGrade2009ofMedicalSchool,UniversityofSouthChina，Hengyang,Hunan421001，China)

ObjectiveTo explore the role of GRP78 in the development of gastric carcinoma by analysis of the expression of GRP78 in gastric carcinoma tissue.Methods48 cases of human gastric carcinoma tissue with different clinical period and differentiation degree and 28 cases of normal gastric tissue were selected.The mRNA and protein of GRP78 were detected by RT-PCR,Western blotting and immunohistochemistry,respectively.ResultsCompared with normal gastric epithelial tissue，the expression of GRP78 at mRNA and protein level in gastric carcinoma tissue increased significantly,which were showed by RT-PCR and Western Blotting(P<0.05).GRP78 protein was mainly distributed in cytoplasm showed by immunohistochemistry.The positive rate of GRP78 in normal gastric tissue,well or moderately-differentiated and poorly-differentiated gastric cancer tissue were 10.7% (3/28),59.4% (19/32) and 93.8% (15/16),respectively.The positive rate of GRP78 in gastric carcinoma tissue with diameter ≥5 cm was 88.9%(16/18),at Ⅲ,Ⅳ period in TNM staging was 90.5% (19/21),and with recurrence or death less than 5 years was 82.8% (24/29),which were higher than that with diameter < 5 cm(60%,18/30),at Ⅰ,Ⅱ period (55.6%,15/27),and with relapse-free in five years(52.6%,10/19),respectively.The positive rate of GRP78 in gastric carcinoma tissue with lymphatic metastasis was 96.2% (25/26)，which was much higher than that of without lymphatic metastasis (40.9%,9/22).ConclusionThe expression of GRP78 in gastric cancer tissue increased,and GRP78 was involved in the development and progression of gastric cancer,which was highly related to tumor size,differentiation,lymph node metastasis,clinical stage and prognosis of gastric cancer.

gastric carcinoma; glucose regulatory protein 78 KD; differentiation; lymph node metastasis; clinical stage

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.01.005

2014-08-06；

2014-11-20

本項目受2012年湖南省大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實驗計劃項目及2012年地方高校國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201210555017)資助.

*通訊作者，E-mail:charlesking8888@163.com.

R735.2

A

(此文編輯：蔣湘蓮)