林樹海 ， 蔡宗葦

（香港浸會大學(xué)化學(xué)系，環(huán)境與生物分析國家重點實驗室，香港999077）

對于分化了的細胞而言，在氧氣充足情況下，可通過糖酵解進入三羧酸循環(huán)，實現(xiàn)葡萄糖的完全氧化，產(chǎn)生大量三磷酸腺苷（ATP）。只有在氧氣不足的時候，才依賴于糖酵解通路產(chǎn)能，并產(chǎn)生大量的乳酸。但腫瘤細胞顯然不同。腫瘤是一種異質(zhì)性疾病，是細胞在失控條件下瘋狂生長，從而影響人體健康的一類惡性疾病。腫瘤細胞與正常細胞的代謝差異早在20 世紀(jì)20 年代就引起德國科學(xué)家奧托-瓦伯格（Otto Warburg）的注意。他通過物理化學(xué)方法，檢測了腫瘤組織與正常組織在泌酸與耗氧方面的差異，總結(jié)出瓦伯格效應(yīng)（Warburg effect）［1，2］。該效應(yīng)提出如下假說：腫瘤細胞主要依賴于糖酵解通路獲得能量，不管氧氣是否存在及氧含量多少，都產(chǎn)生過量的乳酸（如圖1 所示）。雖然糖酵解通路是一條效率低下的產(chǎn)能通路，這種能量供應(yīng)方式也被稱為需氧糖酵解。這項假說提出以后，有長達數(shù)十年被人們所遺忘，直到20 世紀(jì)90 年代才開始有人重新研究瓦伯格效應(yīng)。對瓦伯格效應(yīng)的理解也逐步深入，并從糖代謝衍生到其他代謝，比如谷氨酰胺代謝、脂代謝等［3，4］。

1 碳-13 標(biāo)記的示蹤分析

圖1 氧氣（a）充足和（b）不足時的糖酵解［3］Fig.1 Glycolysis under （a）high and （b）limited oxygen conditions［3］

為了更好地理解腫瘤代謝的變化規(guī)律，我們需要一種新的檢測方法。同位素標(biāo)記的示蹤分析方法就是讓癌細胞攝取含有同位素標(biāo)記的營養(yǎng)物質(zhì)，如葡萄糖、谷氨酰胺等，然后檢測其他中間代謝產(chǎn)物的同位素標(biāo)記情況，反映出癌細胞中的代謝調(diào)控［5］。在細胞培養(yǎng)中，可以先用全碳-13 標(biāo)記的葡萄糖與沒有同位素標(biāo)記（碳-12）的谷氨酰胺混合，共同在細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞一段時間（比如24 h），然后收集細胞并提取代謝物做代謝流分析（如圖2 中所示的紅色標(biāo)記的碳-13）。另一種情況就是采用全碳-13 標(biāo)記的谷氨酰胺與沒有同位素標(biāo)記（碳-12）的葡萄糖混合，共同在細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞一段時間，所得細胞代謝物用于代謝流分析（如圖2 中所示的藍色標(biāo)記的碳-13）。利用超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜可以提高分析的靈敏度與選擇性。在不同的代謝反應(yīng)中，同一代謝物因含不同數(shù)目的碳-13 標(biāo)記，母離子與子離子質(zhì)荷比也不同。經(jīng)優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)后定量分析，可判別細胞中的代謝切換。例如，含有4 個碳-13 的蘋果酸可來源于谷氨酰胺氧化代謝通路，而含3 個碳-13 的蘋果酸則可來源于谷氨酰胺還原代謝通路。現(xiàn)以著名的癌基因Kras 為例來討論糖代謝與谷氨酰胺代謝。Kras 是一個重要基因，在腫瘤細胞生長、增殖以及血管生成等過程的信號傳導(dǎo)通路中起著“開關(guān)”作用，從而影響腫瘤的生長和擴散。Ying 等［6］采用碳-13 標(biāo)記的葡萄糖培養(yǎng)癌基因Kras 高表達的癌細胞，然后通過質(zhì)譜檢測含有碳-13 的中間代謝物，包括糖酵解通路與三羧酸循環(huán)。這種同位素標(biāo)記示蹤分析技術(shù)可判別代謝的速率和方向的改變。后來又進一步采用碳-13 標(biāo)記的谷氨酰胺培養(yǎng)癌細胞，也同樣檢測碳-13 標(biāo)記的代謝物［7］。有趣的是，從谷氨酰胺進入三羧酸循環(huán)有兩條通路，一條是氧化代謝途徑，另一條是還原反應(yīng)代謝途徑。如圖2 所示，質(zhì)譜技術(shù)檢測到的三羧酸循環(huán)代謝產(chǎn)物，其碳源可能有3 條途徑；一條是糖酵解；一條是在線粒體中進行的谷氨酰胺氧化代謝；另一條則是在胞漿中進行的谷氨酰胺還原代謝?；谫|(zhì)譜的同位素示蹤技術(shù)體現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢，可定量分析細胞代謝的動態(tài)變化。這一分析技術(shù)越來越得到重視和廣泛應(yīng)用。再如新近《分子細胞》雜志報道的美國德州西南醫(yī)學(xué)中心DeBerardinis 博士課題組［8］的工作，他們發(fā)現(xiàn)在腫瘤細胞中，當(dāng)線粒體的丙酮酸運載體失活的時候，谷氨酰胺的氧化代謝即可保持三羧酸循環(huán)運轉(zhuǎn)并維持細胞存活。線粒體的丙酮酸運載體是從葡萄糖進入三羧酸循環(huán)中的一個關(guān)鍵蛋白。這個關(guān)鍵蛋白的活性一旦異常，會影響到葡萄糖代謝。但令人驚訝的是，谷氨酰胺代謝即可起到替代作用。從圖2 中還可以看到，谷氨酰胺進入細胞，代謝成谷氨酸，進而脫氨生成α-酮戊二酸。DeBerardinis 課題組［9］還報道了在線粒體缺失的腫瘤細胞中，谷氨酰胺還原代謝同樣是需要的，并且這種還原代謝與α-酮戊二酸的氧化代謝同等重要，也就是說腫瘤細胞中可利用三羧酸循環(huán)的雙重代謝來實現(xiàn)快速增殖所需要的能量需求。這從本質(zhì)上講，谷氨酰胺代謝早已超出瓦伯格效應(yīng)的研究范疇，打破了過去一直認為的腫瘤細胞的線粒體不活躍的說法。

除了葡萄糖、谷氨酰胺之外，代謝組學(xué)結(jié)合同位素標(biāo)記的示蹤分析可鑒定其他重要的代謝物。2012年《科學(xué)》雜志就報道了代謝組學(xué)與碳-13 標(biāo)記的示蹤技術(shù)鑒定出甘氨酸在60 種腫瘤細胞株中對促進細胞生長起到重要作用［10］。今年5 月《細胞報道》［11］和9 月的《癌發(fā)現(xiàn)》［12］又分別提出另一代謝物絲氨酸可能比甘氨酸更重要，特別是進入一碳代謝后更容易促進細胞增殖與生長。由此可見，同位素標(biāo)記示蹤技術(shù)這一分析化學(xué)方法在判別腫瘤細胞的代謝變化規(guī)律時有獨特的優(yōu)勢。

2 氘代標(biāo)記的示蹤分析

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸是一種極為重要的核苷酸類輔酶，它是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD＋）中與腺嘌呤相連的核糖環(huán)系2′-位的磷酸化衍生物，參與多種合成代謝反應(yīng)，如脂類、脂肪酸和核苷酸的合成。這些反應(yīng)中需要還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）作為還原劑、氫負供體，NADPH 是NADP＋的還原形式。NADPH 對細胞生長與增殖、抗氧化都具有重要意義［13］。中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院吳緬教授與美國賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院楊小魯教授合作，在癌癥代謝機制研究中取得一項新的突破性發(fā)現(xiàn)，即證實p73 蛋白激活了癌細胞中的磷酸戊糖途徑，支持了腫瘤細胞的增殖［14］。吳緬和楊小魯課題組經(jīng)過多年合作研究發(fā)現(xiàn)，p73 是通過一條葡萄糖代謝旁路即磷酸戊糖途徑，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。他們通過實驗證明，高表達的p73 使葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）這一關(guān)鍵酶的活性大大增強，從而激活了在正常細胞中較少被使用的代謝旁路，即磷酸戊糖途徑，細胞中大量的葡萄糖通過這一旁路被消耗。這一代謝途徑無法產(chǎn)生細胞生長必需的能量，而是產(chǎn)生大量戊糖與強還原劑NAPDH，前者用于合成核苷酸，后者則會參與脂肪酸合成和清除一種對腫瘤細胞有抑制作用的氧化物，即活性氧自由基（reactive oxygen species：ROS），從而滿足腫瘤細胞無限、旺盛的生長。

圖2 全碳-13 標(biāo)記的葡萄糖與未標(biāo)記谷氨酰胺培養(yǎng)的癌細胞，以及未標(biāo)記葡萄糖與全碳-13 標(biāo)記的谷氨酰胺培養(yǎng)的癌細胞的代謝通路Fig.2 Metabolic pathways in cancer cells fed with［U-13 C6］-glucose and unlabeled glutamine or unlabeled glucose and［U-13C5］-glutamine

為了分析檢測代謝底物轉(zhuǎn)化為NADPH 的動態(tài)變化，今年6 月和7 月的《自然》［15］與《分子細胞》［16］分別報道了基于質(zhì)譜的氘代示蹤技術(shù)定量分析細胞中不同代謝通路產(chǎn)生NADPH 的差異與動態(tài)規(guī)律。目前普遍認為哺乳細胞中有約60%的NADPH 來自磷酸戊糖途徑，但新的研究表明，在某些腫瘤細胞中，磷酸戊糖途徑與蘋果酸酶約各貢獻30%的NADPH，而一碳代謝卻產(chǎn)生約40%的NADPH。這意味著一碳代謝可能更重要。為了進一步在細胞中定位（區(qū)域化），可采用氘代的方法標(biāo)記營養(yǎng)物并用于細胞培養(yǎng)中。絲氨酸與甘氨酸作為一碳代謝的前體代謝物，可經(jīng)由一碳代謝產(chǎn)生NADPH。在細胞培養(yǎng)中，Lewis 等［16］用［2，3，3-2H3］標(biāo)記的絲氨酸追蹤檢測［2H］-NADPH，發(fā)現(xiàn)絲氨酸轉(zhuǎn)化為甘氨酸這一過程在線粒體中的絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶2 催化下產(chǎn)生NADPH（見圖3a）；另外，用類似的辦法，用［2，2-2H2］標(biāo)記甘氨酸發(fā)現(xiàn)甘氨酸可以通過甘氨酸脫羧酶催化產(chǎn)生NADPH（見圖3b）。

圖3 線粒體中的一碳代謝［16］Fig.3 One-carbon metabolism in mitochondria［16］

3 前景展望

穩(wěn)定同位素標(biāo)記稀釋技術(shù)很早就被用作內(nèi)標(biāo)，但細胞攝取同位素標(biāo)記的營養(yǎng)物，根據(jù)生物化學(xué)反應(yīng)規(guī)律探尋該同位素的轉(zhuǎn)歸則是分析化學(xué)與生物化學(xué)相結(jié)合產(chǎn)生的一門新興技術(shù)方法。目前采用最多的是碳-13 標(biāo)記，用于分析細胞代謝物的碳源差異。本文重點討論的是碳-13 標(biāo)記與氘代標(biāo)記的示蹤分析技術(shù)用于定量分析細胞代謝中不同通路的差異。其中氘代示蹤分析技術(shù)改變了生物化學(xué)中傳統(tǒng)的觀點，即NADPH 約60%來源于磷酸戊糖途徑。實際上可能沒那么多來自磷酸戊糖途徑，至少在腫瘤細胞中如此。一碳代謝的重要性必須得到重視，其對腫瘤細胞而言可能更為重要。未來的研究可能還將采用氮-15 標(biāo)記分析氨基酸和核苷的合成規(guī)律，對深入理解細胞中的生物化學(xué)反應(yīng)提供重要證據(jù)。這也是代謝組學(xué)，特別是代謝流分析技術(shù)帶來的優(yōu)勢。

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