李 勇， 林 茜， 逄 濤* ， 師君麗

（1. 云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南 玉溪653100；2. 玉溪師范學(xué)院，云南 玉溪653100）

類黃酮物質(zhì)（flavonoids）是指兩個苯環(huán)通過中央三碳原子相互連接的一系列化合物［1］，它們廣泛分布于植物中，是植物重要的次生代謝產(chǎn)物。類黃酮物質(zhì)在很多植物體中已被證明與植物的抗蟲［2］和抗?。?］能力相關(guān)。黃酮類化合物是一類生物活性很強(qiáng)的化合物，是一種天然的抗氧化劑，在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用［4，5］。煙草中類黃酮化合物（包括類黃酮糖苷及其苷元）還是煙草香味物質(zhì)的重要前體，其分解產(chǎn)物與煙草的香氣質(zhì)和香氣量有關(guān)［6］。在煙葉的調(diào)制、醇化和燃燒過程中，黃酮類化合物可氧化分解，賦予優(yōu)雅的清香氣味，增加香氣量，因此它們對改善煙草制品的品質(zhì)有重要的作用。

目前，關(guān)于煙草中類黃酮物質(zhì)的分析檢測方法已有報道。1965 年，Watanabe 和Wender［7］采用溶劑提取和紙色譜分離的方法從煙草花的雄蕊中分離出蕓香苷、山柰酚苷、異槲皮苷、黃芪苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、煙花苷等黃酮類化合物。1992 年，Snook 等［2］采用液相色譜系統(tǒng)研究了66 種煙草花中的黃酮類物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)不同煙草花中黃酮類物質(zhì)差異很大。2007 年，Pang 等［8］采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法從煙葉中分離鑒定出蕓香苷、山柰酚苷、槲皮苷等化合物。2014 年，本文作者Li 等［9］從煙草的葉和花中鑒定出17 種類黃酮物質(zhì)，其中9 種為煙草中首次被鑒定出來。目前，煙草中類黃酮物質(zhì)的定量分析方法主要只涉及含量最高的蕓香苷和山柰酚-3-O-蕓香糖苷［10-20］。這主要是由于傳統(tǒng)的高效液相色譜法靈敏度較低，無法檢測到低含量的類黃酮物質(zhì)，部分類黃酮物質(zhì)之前未被鑒定也是原因之一。隨著人們對煙草中類黃酮物質(zhì)關(guān)注的增加，建立一種類黃酮物質(zhì)全面定量分析方法很有必要。

本研究以作者的前期工作為基礎(chǔ)，對從煙草的葉和花中鑒定出的17 種類黃酮物質(zhì)進(jìn)行定量方法研究，建立了其中12 種類黃酮物質(zhì)（其余5 種在煙葉中未檢出或未獲得相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)樣品）的定量分析方法。該方法的建立對于全面關(guān)注煙葉中類黃酮物質(zhì)的含量分布具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 試劑及裝置

乙腈、甲醇、乙醇（色譜純，德國Merck 公司）。超純水由Millipore 公司的純化系統(tǒng)制備。二氫山柰酚（aromadendrin）、二氫槲皮素（taxifolin）、槲皮素（quercetin）、蕓香苷（quercetin-3-O-rutinoside）、山柰酚-3-O-蕓香糖苷（kaempferol-3-O-rutinoside）、異鼠李素（isorhamnetin）、槲皮素-3-O-葡萄糖苷（quercetin-3-O-glucoside）、木犀草素（luteolin）、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷（isorhamnetin-3-Oglucoside）、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷（isorhamnetin-3-O-rutinoside）、山柰酚-3-O-葡萄糖苷（kaempferol-3-O-glucoside）、柚皮素-7-O-葡萄糖苷（naringenin-7-O-glucoside）等標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)以及黃豆苷元（daidzein）、染料木苷（genistin）、橙皮苷（hesperidin）等內(nèi)標(biāo)物質(zhì)購買于Sigma-Aldrich，Alfa Aesar和百靈威公司。

美國Waters 公司超高效液相色譜（UPLC）儀，美國AB 公司AB SCIEX 5500 三重四極桿質(zhì)譜儀。SB-50D 超聲波提取儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Milli-Q 純水機(jī)（美國Millipore 公司），LD5-2A 離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司），渦旋混勻器（荷蘭Breda 公司）；CP2245 分析天平（感量0.000 1 g，德國Sartorious 公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

初步估計，二氫山柰酚、二氫槲皮素、槲皮素、異鼠李素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、木犀草素、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、柚皮素-7-O-葡萄糖苷等物質(zhì)（以下稱“低濃度類黃酮”）的濃度梯度在1 ～10 000 μg／L之間，蕓香苷和山柰酚-3-O-蕓香糖苷（以下稱“高濃度類黃酮”）的濃度梯度在0.1 ～100 mg／L 之間。因此先配制所有標(biāo)準(zhǔn)化合物的1 g／L 的單標(biāo)準(zhǔn)溶液（甲醇為溶劑）。分別移取100 μL 1 g／L 的低濃度類黃酮單標(biāo)準(zhǔn)溶液以及10 mL 1 g／L 的高濃度類黃酮單標(biāo)準(zhǔn)溶液于100 mL 容量瓶中，以樣品提取溶液（甲醇-氯仿-水（5 ∶2 ∶2，v／v／v））定容，制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。以樣品甲醇-水-氯仿（5 ∶2 ∶2，v／v／v）逐級稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成低濃度類黃酮物質(zhì)的質(zhì)量濃度為1 000、600、400、100、60、40、10、6、4、1 μg／L，體積為1 mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。此濃度梯度對應(yīng)的高濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液梯度為100、60、40、10、6、4、1、0.6、0.4、0.1 mg／L。在所有濃度梯度的溶液中加入200 μL內(nèi)標(biāo)混合液。內(nèi)標(biāo)混合液為1.0 mg／L 黃豆苷元、染料木苷、橙皮苷的水溶液。黃豆苷元、染料木苷、橙皮苷分別用于校正無糖基類黃酮苷元、葡萄糖基取代類黃酮和蕓香糖基取代類黃酮。

1.3 樣品前處理

樣品信息：煙草品種K326、云煙87、N. rustica、N. alata、GN23、N. plumbaginifia、G285、紅大、云煙85、N. lamgiflora、N. occidentalis 等種植于云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院的“世界煙草品種園”（玉溪市研和鎮(zhèn)）。煙葉樣品為成熟期的中部煙葉。

樣品制備：將新鮮的煙葉樣品放入研缽，加液氮冷凍，并迅速研磨粉碎。磨好的樣品迅速轉(zhuǎn)入凍干機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，除去水分，置于4 ℃冰箱保存。

樣品提取：準(zhǔn)確稱取10.0 mg 凍干煙葉樣品，加入1 mL 甲醇-水-氯仿（5 ∶2 ∶2，v／v／v）和200 μL內(nèi)標(biāo)混合液，超聲30 min，離心，取上清液轉(zhuǎn)入液相色譜進(jìn)樣小瓶中供分析。

1.4 色譜-質(zhì)譜分析條件

色譜條件：Waters BEH C18 色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm；美國Waters 公司）；流動相：A 相為水；B 相為乙腈，兩相中均添加0.1% （v／v）甲酸和0.2 mmol／L 乙酸銨；梯度洗脫程序：0 ～1.0 min，10% B；1.0 ～9.0 min，10% B ～90% B；9.0 ～11.0 min，90% B ～100% B；11.0 ～11.1 min，100%B ～10% B；11.1 ～13.0 min，10% B。柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：2 μL；流速：0.25 mL／min。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離離子源；負(fù)離子掃描模式；噴霧電壓-4 000 V；氣簾氣壓力275.790 kPa；離子源溫度700 ℃；輔助氣1 壓力413.685 kPa；輔助氣2 壓力344.738 kPa；去簇電壓-100 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜流動相及其添加劑的選擇

對比分析了乙腈-水和甲醇-水兩種流動相體系，發(fā)現(xiàn)兩者的分離效果相當(dāng)，但采用甲醇-水體系時色譜系統(tǒng)的柱壓力較大。由于本實驗采用的是1.7 μm 的超高效液相色譜柱，采用甲醇-水體系時很容易使色譜系統(tǒng)的柱壓力達(dá)到儀器耐受壓力的上限103.4 MPa，造成系統(tǒng)的不穩(wěn)定，因此實驗最終采用乙腈-水流動相體系。

比較分析了乙酸銨和甲酸兩種常見添加劑對類黃酮物質(zhì)分離和響應(yīng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加乙酸銨后化合物的色譜峰形得到改善，但響應(yīng)靈敏度卻有所降低。添加甲酸在正離子和負(fù)離子模式下均能夠增加化合物的靈敏度，但會降低化合物在反相色譜柱上的保留。因此最終本實驗采用0.1% 甲酸和0.2 mmol／L 乙酸銨同時加入A 相和B 相作為色譜分離和靈敏度的改進(jìn)劑。優(yōu)化條件下實際樣品的色譜圖見圖1。

2.2 質(zhì)譜條件的確定

采用流動注射的方法對質(zhì)譜離子源參數(shù)和具體化合物的定量離子、碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。其中質(zhì)譜定量離子的選定原則為從標(biāo)準(zhǔn)化合物的二級質(zhì)譜中初步選取4 個響應(yīng)較強(qiáng)的碎片離子，對4 個離子依次進(jìn)行碰撞能量的優(yōu)化，得到每個離子的最佳碰撞能，對比最佳碰撞能時4 個離子的信噪比，選取信噪比最大的兩個離子作為本方法的定量離子。最終得到定量分析的離子源參數(shù)見1.4 節(jié)?；衔锏亩侩x子及碰撞能量參數(shù)見表1。

表1 類黃酮物質(zhì)的UPLC-MS／MS 分析的保留時間、定量離子及碰撞能量Table 1 Retention times，quantitative ions and collision energies of flavonoids by UPLC-MS／MS

2.3 提取方法的選擇

本實驗試圖找到一種簡單、高效、快速的類黃酮物質(zhì)提取方法，并盡可能地減少雜質(zhì)的提取。比較了水、甲醇、乙醇、甲醇-水（3 ∶1，v／v）、乙醇-水（3 ∶1，v／v）、甲醇-水-氯仿（5 ∶2 ∶2，v／v／v）等多酚或類黃酮物質(zhì)常用提取溶劑的提取效果。由于本研究涉及的類黃酮物質(zhì)中蕓香苷和山柰酚-3-O-蕓香糖苷在總類黃酮物質(zhì)中的含量占比較高（本實驗中兩者占總類黃酮含量的85% 以上），只采用類黃酮峰面積總和進(jìn)行方法評價無法體現(xiàn)含量較低的類黃酮物質(zhì)的提取效果。因此本實驗采用了兩種不同的方法進(jìn)行不同萃取方法的萃取效果比較。第一種方法為類黃酮物質(zhì)色譜峰面積總和比較（見圖2a），該方法中含量較高的類黃酮化合物權(quán)重較大；第二種方法為色譜峰面積在各處理之間的排序（升序）總和比較（見圖2b），該方法中每個類黃酮化合物的權(quán)重相同，因此減少了蕓香苷和山柰酚-3-O-蕓香糖苷等高含量物質(zhì)對比較結(jié)果的影響。兩種比較方式得到的結(jié)果都是乙醇-水（3 ∶1，v／v）和甲醇-水-氯仿（5 ∶2 ∶2，v／v／v）兩種溶劑的提取效果最好，且兩者的提取效果差別不大。由于甲醇-水-氯仿（5 ∶2 ∶2，v／v／v）提取后可以通過離心將氯仿層去除，氯仿層萃取了大部分的葉綠素，而葉綠素等色素采用本實驗的色譜條件很難將其從色譜柱上洗脫下來（反相色譜條件下通常需要用異丙醇才能將色素沖洗下來），批量進(jìn)樣有可能損壞色譜柱，影響類黃酮物質(zhì)的正常分析，因此本實驗最終選取甲醇-水-氯仿（5 ∶2 ∶2，v／v／v）作為煙葉中類黃酮物質(zhì)的提取溶劑。

圖2 兩種方法比較不同萃取溶劑的萃取效果（n＝2）Fig.2 Comparison of extraction effects among different extraction solutions by two methods （n＝2）

2.4 方法驗證

按照1.4 節(jié)所述的方法配制系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，發(fā)現(xiàn)所有化合物的線性相關(guān)系數(shù)（r2）均在0.99 以上，說明所建立的方法具有很好的線性響應(yīng)，適合定量分析。對這些化合物進(jìn)行檢出限和定量限評估，發(fā)現(xiàn)不同化合物的檢出限和定量限相差較大，其中異鼠李素-3-葡萄糖苷、二氫槲皮素、柚皮素-7-葡萄糖、二氫山柰酚、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷的定量限可達(dá)到1.2 ～5.6 μg／L，而槲皮素-3-O-蕓香苷、山柰酚-3-O-蕓香苷以及木犀草素、異鼠李素、槲皮素的定量限在0.065 ～0.4 mg／L 之間（見表2）。對類黃酮物質(zhì)進(jìn)行重復(fù)性考察，發(fā)現(xiàn)所考察的類黃酮物質(zhì)的日內(nèi)重復(fù)性在3.5% ～7.4% 之間，日間重復(fù)性在5.2% ～11.4% 之間（見表3）。根據(jù)類黃酮物質(zhì)在本實驗所測定的11 種煙草中的平均濃度，添加約50% 和100% 平均濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品至實際樣品中，測得方法的回收率在81.2% ～111.9% 之間（見表3）。

表2 類黃酮化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限Table 2 Linear equations，correlation coefficients （r2），linear ranges，limits of detection （LODs，S／N＝3）and limits of quantification （LOQs，S／N＝10）of the flavonoids

表3 類黃酮化合物的重復(fù)性和回收率Table 3 Reproducibilities and recoveries of the flavonoids

2.5 煙葉中類黃酮含量分布

圖3 類黃酮物質(zhì)總量在11 種不同煙葉品種中的含量分布（n＝2）Fig.3 Distribution of the flavonoids in 11 varieties of tobacco （n＝2）

利用所建立的類黃酮物質(zhì)定量方法，分析了11種煙葉中類黃酮物質(zhì)的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同品種煙葉中類黃酮物質(zhì)的總含量差異很大，其中N. alata中的含量最低，為0.38 mg／g；N. rustica 中的含量最高，達(dá)14.3 mg／g （見圖3）。從各種類黃酮物質(zhì)的含量看，蕓香苷和山柰酚-3-O-蕓香糖苷是含量較高的類黃酮物質(zhì)，二氫山柰酚、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、柚皮素-7-O-葡萄糖苷等含量較低。蘆丁、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷、二氫槲皮素、柚皮素-7-O-葡萄糖苷、二氫山柰酚、木犀草素、槲皮素、異鼠李素等類黃酮物質(zhì)分別在N. alata（0.14 mg／g），N. plumbaginifia（11.30 μg／g），N. alata（0.07 mg／g），N. plumbaginifia（0.79 μg／g），N. alata （2.12 μg／g），N.plumbaginifia（4.24 μg／g），云煙85（0.77 μg／g），N. rustica（0.16 μg／g），云煙85（未檢出），云煙85、N. lamgiflora、N. occidentalis（均未檢出），云煙87（35.94 μg／g），云煙85、N. plumbaginifia、N. lamgiflora、N. occidentalis（均未檢出）中含量最低；在N.rustica（13.33 mg／g）、N. lamgiflora（221.68 μg／g）、N.plumbaginifia（2.32 mg／g）、GN23（2.55 μg／g）、N.plumbaginifia（28.74 μg／g）、GN23 （87.42 μg／g）、N. alata（4.50 μg／g）、GN23（3.31 μg／g）、N. alata（0.90 μg／g）、K326（50.19 μg／g）、N. rustica（46.88 μg／g）、K326（51.09 μg／g）中含量最高。

對類黃酮物質(zhì)在11 種不同品種煙葉中的含量分布進(jìn)行皮爾森相關(guān)關(guān)系研究（見表4），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蕓香苷與槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素等化合物呈顯著正相關(guān)關(guān)系，山柰酚-3-O-蕓香糖苷與山柰酚-3-O-葡萄糖苷呈顯著正相關(guān)關(guān)系，異鼠李素-3-O-葡萄糖苷與異鼠李素-3-O-蕓香糖苷、異鼠李素等化合物呈顯著正相關(guān)關(guān)系。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看它們之間只存在糖基的差別，而類黃酮苷元是糖苷生成的原料化合物，因此苷元的含量決定了糖苷的含量。而含相同苷元的不同糖苷之間的正相關(guān)關(guān)系說明不同糖苷（含相同苷元）的生成化學(xué)反應(yīng)之間不存在競爭關(guān)系。異鼠李素與木犀草素、槲皮素與二氫槲皮素、二氫槲皮素與二氫山柰酚之間存在顯著正相關(guān)關(guān)系，從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看它們之間只存在一個基團(tuán)的差別，它們的含量應(yīng)是由共同的上游原料決定的，且它們生成的化學(xué)反應(yīng)之間也不存在競爭關(guān)系。

表4 類黃酮化合物之間的皮爾森相關(guān)關(guān)系Table 4 Pearson correlations of the determined flavonoids

3 結(jié)論

本研究建立了一種基于UPLC-MS／MS 的煙葉中12 種類黃酮物質(zhì)的定量分析方法。該方法將現(xiàn)有類黃酮分析方法的分析指標(biāo)從2 個擴(kuò)展到12 個。方法簡單、快速、準(zhǔn)確、覆蓋面廣。將所建立的方法用于11 種不同煙葉的分析，發(fā)現(xiàn)不同煙葉之間的類黃酮物質(zhì)含量相差很大，而結(jié)構(gòu)相似的類黃酮物質(zhì)在煙葉中的含量分布存在正相關(guān)關(guān)系。該方法的建立對開展煙草類黃酮物質(zhì)的相關(guān)研究具有重要的參考意義。

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