邱盼子， 郭欣妍， 王 娜* ， 孔祥吉， 何 華

（1. 環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所，江蘇 南京210042；2. 中國(guó)藥科大學(xué)理學(xué)院，江蘇 南京211198）

隨著我國(guó)抗生素產(chǎn)品國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力的不斷增強(qiáng)，抗生素藥物的年產(chǎn)量大大增加，生產(chǎn)過程中所產(chǎn)生的制藥廢水量也逐年增加。實(shí)際生產(chǎn)中，制藥廢水的處理多采用以生物處理為主、結(jié)合物化處理工藝的常規(guī)廢水處理工藝。然而，現(xiàn)有的廢水處理技術(shù)不能將其中殘留的抗生素完全去除，大部分抗生素會(huì)經(jīng)不同途徑對(duì)土壤和水體造成污染［1，2］。

由于抗生素環(huán)境污染存在隱蔽性與長(zhǎng)效性的特點(diǎn)，針對(duì)抗生素的環(huán)境管理一直處于盲區(qū)，致使抗生素的環(huán)境污染持續(xù)處于加重的態(tài)勢(shì)［3］，嚴(yán)重影響了抗生素生產(chǎn)的社會(huì)效益與經(jīng)濟(jì)利益。制藥廠廢水處理工藝能否有效去除抗生素，對(duì)抗生素污染的源頭控制起著重大作用。目前，大環(huán)內(nèi)酯類（MLs）、氨基糖苷類（AGs）及氟喹諾酮類（FQNs）抗生素是我國(guó)醫(yī)藥、畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)應(yīng)用廣泛的幾類抗生素［4-7］，在我國(guó)產(chǎn)量巨大。本研究所選取的10 種抗生素一般作為人用抗生素，環(huán)境暴露少，制藥廢水是環(huán)境中這些抗生素的主要來源之一，對(duì)公眾健康和環(huán)境安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。因此建立制藥廢水中此類物質(zhì)的分析測(cè)定方法，可為進(jìn)一步研究其在制藥廠廢水處理系統(tǒng)中的消解動(dòng)態(tài)提供技術(shù)支持。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是檢測(cè)環(huán)境樣品中抗生素含量的一種重要方法，其靈敏度高，特異選擇性好，抗背景干擾能力強(qiáng)，能對(duì)含量低的樣品進(jìn)行很好的定量分析檢測(cè)［8，9］。但由于氨基糖苷類抗生素極性大，且為離子型化合物，很難保留在反相色譜柱上。因此多在流動(dòng)相中添加一定濃度的七氟丁酸（HFBA），通過與被測(cè)物形成離子對(duì)增強(qiáng)其色譜保留［10，11］。但HFBA 會(huì)在質(zhì)譜中積累而污染質(zhì)譜，影響儀器的靈敏度，不利于儀器后續(xù)的穩(wěn)定使用。本研究以甲酸代替七氟丁酸，使氨基糖苷類抗生素獲得了較好的峰形和較高的響應(yīng)，并利用固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（SPE-UPLC-MS／MS）技術(shù)，建立了制藥廢水中10 種目標(biāo)抗生素的高靈敏檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（LC 為Agilent Technologies 的1290 Infinity，MS 為美國(guó)AB 公司的SCIEX QTRAP 4500）；Agilent C18 色譜柱（75 mm×2.1 mm，2.7 μm）（美國(guó)Agilent 公司）；真空冷凍干燥機(jī)（Benchtop K，Virtis，美國(guó)）；高速冷凍離心機(jī)（CR22GII，Sigma，德國(guó)）；Milli-Q 超純水器（Millipore，美國(guó)）；AG-285 電子天平（Mettler，瑞士）；MG-2200 氮吹儀（EYELA，日本）；12 通道固相萃取裝置（Waters，美國(guó)）；Waters Oasis HLB 固相萃取柱（200 mg，6 mL，粒徑為30 μm，親水親脂平衡的水可浸潤(rùn)性的反相吸附）；Waters Oasis WCX 固相萃取柱（150 mg，6 mL，粒徑為30 μm，混合型弱陽(yáng)離子交換反相吸附劑）；Waters Oasis MCX 固相萃取柱（60 mg，3 mL，粒徑為30 μm，混合型陽(yáng)離子交換反相吸附劑）；Waters Oasis WAX固相萃取柱（60 mg，3 mL，粒徑為30 μm，混合型弱陰離子交換反相吸附劑）（Waters，美國(guó)）。

乙腈、甲醇和甲酸為色譜純（Merck，德國(guó)）；試驗(yàn)用水為經(jīng)Milli-Q 凈化系統(tǒng)（0.22 μm 孔徑過濾膜）處理的超純水。

1.2 供試藥品

標(biāo)準(zhǔn)品：巴龍霉素（paromomycin，PAR，純度99.0%），核 糖 霉 素（ribostamycin，RI，純 度99.0%），依替米星（etimicin，ET，純度99.0%），奈替米星（netilmicin，NE，純度99.0%），西索霉素（sisomicin，SI，純度99.0%），小諾霉素（micronomicin，MI，純度99.0%），巴洛沙星（balofloxacin，BA，純度99.0%），帕珠沙星（pazufloxacin，PA，純度99.0%），螺旋霉素（spiramycin，SP，純度99.0%），氟羅沙星（fleroxacin，F(xiàn)L，純度99.0%）?？股貥?biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)于德國(guó)Dr. Ehrenstorfer 公司。10 種目標(biāo)抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

3 種氟喹諾酮類抗生素和螺旋霉素用甲醇配制成為1000 mg／L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，6 種氨基糖苷類藥物因難溶于有機(jī)試劑而使用20% （v／v）的乙腈水溶液配制成為1000 mg／L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存于4 ℃的冰箱中。用甲醇配制上述10 種抗生素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度為10 mg／L。

1.3 采樣方法

圖1 10 種抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of the ten antibiotics

廢水水樣取自江蘇省某藥廠污水處理系統(tǒng)。采樣在2014 年11 月3、12、20、29 日進(jìn)行，每天采樣3次，每8 h 采樣1 次，每次從各采樣點(diǎn)取樣1 L。所采集的廢水為混合水樣，包括原水、調(diào)節(jié)池水、厭氧塔水、水解池水、好氧池水、二沉池水、混凝池水、最終出水，全部水樣盛裝于潔凈的棕色玻璃采樣瓶?jī)?nèi)，防止樣品發(fā)生光解作用導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)。盡快運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室并保存于4 ℃的冰箱內(nèi)，保持樣品的原始狀態(tài)。48 h 內(nèi)完成廢水中殘留抗生素的分析測(cè)定。

1.4 樣品處理

準(zhǔn)確量取經(jīng)0.45 μm 玻璃纖維濾膜過濾的水樣250 mL，用甲酸調(diào)節(jié)pH 為3.0 ～4.0，使目標(biāo)抗生素完全離子化，利于其被固相吸附劑完全吸附保留。預(yù)先依次用6 mL 甲醇、6 mL 超純水淋洗活化WCX 固相萃取柱。樣品溶液上柱時(shí)控制流速為3～5 mL／min。過柱完成后，用6 mL 超純水沖洗WCX 柱，最大程度除去柱內(nèi)殘留干擾物。抽真空30 min，盡量去除柱中殘留水分。最后以10 mL 含5% （v／v）甲酸的甲醇溶液分3 次洗脫，收集洗脫液并在室溫下用N2吹至近干，用乙腈-0.2% （v／v）甲酸水溶液（1 ∶9，v／v）定容至1 mL，渦旋振蕩2 ～3 min，10 000 r／min 下離心10 min，取上清液待分析。

1.5 UPLC-MS／MS 測(cè)定

1.5.1 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子（ESI）源正電離模式、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）掃描。氣簾氣（curtain gas，CUR）壓力為206 851.8 Pa，噴霧氣（ion source gas 1，GS1）壓力為241 327.1 Pa，輔助加熱氣（ion source gas 2，GS2）壓力為275 802.4 Pa，源溫度（temperature，TEM）為450 ℃，離子化電壓（ion spray voltage，IS）為5 500 V，碰撞氣（collision gas，CAD）壓力為41 370.36 Pa。其他參數(shù)見表1。

表1 目標(biāo)抗生素主要的MRM MS 參數(shù)Table 1 MRM MS parameters for the target antibiotics

1.5.2 色譜條件

柱溫：35 ℃；流動(dòng)相：（A）0.2% （v／v）甲酸水溶液和（B）乙腈，流速0.2 mL／min；進(jìn)樣量：5 μL；流動(dòng)相梯度：0.01 ～7.00 min，90% A ～60% A；7.01～8.00 min，90% A。

1.6 分析方法的質(zhì)量控制

采用全程空白和平行樣對(duì)分析過程進(jìn)行質(zhì)量控制，確保結(jié)果的可靠性。處理數(shù)據(jù)時(shí)，采用標(biāo)準(zhǔn)添加法對(duì)各目標(biāo)抗生素在制藥廢水基質(zhì)中存在的不可忽略的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行校正。環(huán)境樣品中可能存在復(fù)雜或未知組分的基質(zhì)影響，標(biāo)準(zhǔn)添加法是降低基質(zhì)效應(yīng)影響的有效措施。將1.4 節(jié)處理的水樣平均分成兩份。其中一份直接進(jìn)樣分析，記錄待測(cè)樣品的峰面積；另一份根據(jù)第一份的檢出情況，精密加入適量各目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)混合工作液，然后進(jìn)樣分析，記錄待測(cè)樣品的峰面積。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)添加法校正公式C ＝S×Rx／（Rs-Rx）計(jì)算樣品濃度。其中C 為校正后的待測(cè)物濃度；S 為標(biāo)準(zhǔn)添加量；Rx和Rs分別為標(biāo)準(zhǔn)溶液添加前、后測(cè)得的待測(cè)樣品峰面積。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜條件的優(yōu)化

氨基糖苷類抗生素（AGs）分子結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)伯氨和仲氨基團(tuán)，呈堿性，極性強(qiáng)。為提高AGs 在反相色譜柱上的保留能力，多使用包括戊基、庚基或己基磺酸鹽的離子對(duì)試劑［11，12］。由于磺酸鹽難揮發(fā)，不適合質(zhì)譜分析，因此一般采用易揮發(fā)的七氟丁酸作為離子對(duì)試劑［13，14］。但七氟丁酸陰離子容易和溶液中的陽(yáng)離子形成緊密的中性離子對(duì)，不能被質(zhì)譜檢出，且會(huì)在質(zhì)譜中累積，污染質(zhì)譜，抑制電噴霧質(zhì)譜信號(hào)而影響檢測(cè)的靈敏度。本文以甲酸代替七氟丁酸，使AGs 獲得了較高的響應(yīng)和較好的峰形。此外，考慮到螺旋霉素在強(qiáng)酸性條件下容易水解，故水相選擇0.2% （v／v）的甲酸水溶液。目標(biāo)抗生素的色譜圖如圖2 所示。

2.1.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

Agilent 1290 超高效液相色譜和AB SCIEX QTRAP 4500 聯(lián)用能夠提供MRM 模式，提高儀器靈敏度。將所研究的10 種目標(biāo)抗生素分別配制成100 ～1 000 μg／L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，直接注入質(zhì)譜儀，進(jìn)樣速度為7 μL／min，根據(jù)目標(biāo)抗生素的分子結(jié)構(gòu)特征，在正離子模式下對(duì)目標(biāo)抗生素實(shí)行半自動(dòng)進(jìn)樣，采用一級(jí)質(zhì)譜對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行母離子全掃描，分析得到［M＋H］＋分子離子峰，然后二級(jí)質(zhì)譜以分子離子為母離子，優(yōu)化CE、DP、EP、CXP 等4 個(gè)參數(shù)，對(duì)各目標(biāo)抗生素的子離子進(jìn)行全掃描，選信噪比較高的兩個(gè)子離子與分子離子組成定性和定量離子對(duì)，信噪比最高的離子對(duì)往往為定量提供了高靈敏度，而其他離子對(duì)則可提供輔助定性信息。在進(jìn)行MRM監(jiān)測(cè)時(shí)選擇信噪比最高的離子對(duì)進(jìn)行檢測(cè)，以提高質(zhì)譜確證的準(zhǔn)確性。

圖2 目標(biāo)抗生素的色譜圖Fig.2 Chromatograms of the target antibiotics

2.2 質(zhì)譜分離

本方法中6 種氨基糖苷類抗生素的保留時(shí)間幾乎相同，帕珠沙星和氟羅沙星的保留時(shí)間亦較為接近，但鑒于質(zhì)譜檢測(cè)器具有強(qiáng)大的質(zhì)量鑒別能力，對(duì)于非同分異構(gòu)的化合物，無(wú)需達(dá)到色譜分離，也可通過不同的質(zhì)量通道進(jìn)行質(zhì)譜分離，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物的專屬測(cè)定。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線與檢出限

采用無(wú)檢出抗生素的空白基質(zhì)，按照1.4 節(jié)所述方法處理后加入目標(biāo)抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成質(zhì)量濃度范圍為0.1 ～1 000 μg／L 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在優(yōu)化的液相色譜和質(zhì)譜條件下進(jìn)行分析。10 種目標(biāo)抗生素均以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（x，mg／L）為橫坐標(biāo)做定量工作曲線，得到的線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)r2在0.995 6 ～0.999 8 之間，表明各目標(biāo)抗生素在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

根據(jù)SPE-UPLC／MS／MS 的定量限（LOQ）公式［15］計(jì)算本方法定量限：

其中：IQL 為儀器的定量限（μg／L），即色譜峰信噪比等于10 時(shí)對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物濃度（見表2）；R 為固相萃取回收率（%），是高、中、低3 個(gè)加標(biāo)水平的回收率的平均值；C 為樣品富集倍數(shù)。準(zhǔn)確量取待測(cè)水樣250 mL，過柱富集并濃縮后，用初始流動(dòng)相定容至1 mL 進(jìn)樣分析，故C 為250。以色譜峰信噪比等于3 確定樣品的檢出限。本文方法的定量限為0.22 ～14.55 ng／L，檢出限為0.07 ～4.37 ng／L（見表2）。

2.3.2 方法的回收率

采用在空白基質(zhì)中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法進(jìn)行添加回收率測(cè)定。分別添加氨基糖苷類抗生素低（0.02 μg／L）、中（1.0 μg／L）、高（40 μg／L）3 個(gè)水平，氟喹諾酮類抗生素和螺旋霉素低（0.002 μg／L）、中（0.10 μg／L）、高（4.0 μg／L）3 個(gè)水平，每個(gè)水平取3 份樣品進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，按1.4 節(jié)方法處理后進(jìn)行UPLC-MS／MS 測(cè)定，采用外標(biāo)法定量。計(jì)算各待測(cè)化合物在空白基質(zhì)中的加標(biāo)回收率（見表3）。6 種AGs 的回收率差異較大，這是因?yàn)? 種AGs 雖然有著相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，但其與陽(yáng)離子交換劑作用的能力差別較大［16］。巴龍霉素、核糖霉素和依替米星的回收率較高（84.1% ～114.1%），可能是由于這3 種AGs 結(jié)構(gòu)中含3 個(gè)或3 個(gè)以上的伯氨基，與陽(yáng)離子交換劑的作用位點(diǎn)多；西索霉素、奈替米星和小諾霉素的結(jié)構(gòu)中也含有多個(gè)伯氨基，但回收率卻不及前3 種AGs，這可能是由于其pKb值較高，與陽(yáng)離子交換劑作用力較弱，被保留在陽(yáng)離子交換柱上的組分較少。氟羅沙星回收率低于其他兩種FQNs，可能是因?yàn)榉_沙星結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)吸電子基（F 原子），酸性較強(qiáng)，故減弱了與陽(yáng)離子交換劑的親和力。雖然后3 種AGs 和氟羅沙星的回收率偏低（50.4% ～70.6%），但是RSD 均較低（1.10%～9.64%），表明該方法比較穩(wěn)定。

表2 10 種抗生素的線性方程、相關(guān)系數(shù)、儀器定量限、檢出限和定量限Table 2 Linear equations，correlation coefficients，instrument quantitative limits （IQL），limits of detection and limits of quantification of the ten antibiotics

表3 水樣中10 種抗生素的加標(biāo)回收率及RSD（n＝3）Table 3 Recoveries and RSDs of the ten antibiotics in water samples （n＝3）

2.3.3 固相萃取柱的選擇

固相萃取技術(shù)是目前測(cè)定抗生素最常用的前處理方法，可選擇不同的固相萃取柱對(duì)水樣中的多種目標(biāo)化合物進(jìn)行萃取和凈化。本實(shí)驗(yàn)分別考察了弱陰離子交換柱（WAX）、混合型強(qiáng)陽(yáng)離子（MCX）、親水親油平衡柱（HLB）及弱陽(yáng)離子（WCX）固相萃取柱對(duì)目標(biāo)抗生素的萃取回收效果（見圖3）。結(jié)果表明：采用WAX 柱時(shí)，10 種目標(biāo)抗生素的回收率幾乎都為0，這是由于WAX 柱是弱陰離子交換柱，10 種目標(biāo)抗生素在酸性（pH 3.0 ～4.0）條件下帶正電荷，很難與陰離子交換劑進(jìn)行離子交換，故被吸附在WAX 柱上的目標(biāo)組分很少；采用MCX 交換柱時(shí)6種AGs 的回收率很低，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)MCX 交換柱對(duì)AGs 等堿性化合物具有高度的選擇性和靈敏度，故AGs 與MCX 交換柱結(jié)合較牢固，難以被洗脫；采用HLB 柱對(duì)3 種FQNs 抗生素的萃取回收率優(yōu)于其他固相萃取柱，但是HLB 柱對(duì)6 種AGs 抗生素的回收效果差。故綜合考慮后選用WCX 柱進(jìn)行富集凈化。比較了500 和150 mg 的WCX 柱，發(fā)現(xiàn)150 mg WCX 柱對(duì)10 種抗生素具有較好的回收率和選擇性。

圖3 固相萃取柱對(duì)10 種抗生素回收率的影響（n＝3）Fig.3 Effect of SPE columns on the recoveries of the ten antibiotics （n＝3）

2.3.4 洗脫液的優(yōu)化

處理后的水樣經(jīng)過WCX 柱后，分別用2% （v／v）甲酸甲醇溶液、5% （v／v）甲酸甲醇溶液和10% 甲酸甲醇溶液洗脫，結(jié)果如圖4 所示。之所以選擇酸性洗脫劑，是因?yàn)閃CX 柱的主要分離模式是陽(yáng)離子交換作用，上樣時(shí)，AGs 陽(yáng)離子與WCX 柱中的H＋交換而使AGs 保留在柱上，用酸性洗脫劑洗脫，使其H＋與保留在柱上的AGs 陽(yáng)離子進(jìn)行交換從而將結(jié)合在離子交換劑上的AGs 洗脫下來。用2% （v／v）甲酸甲醇溶液洗脫時(shí)，10 種目標(biāo)抗生素的回收率在19.0% ～79.0% 之間，隨著甲酸體積分?jǐn)?shù)增加至5% 時(shí)，10 種目標(biāo)抗生素的回收率達(dá)到最大，為50.4% ～114.1%；繼續(xù)增加甲酸體積分?jǐn)?shù)至10% 時(shí)，10 種目標(biāo)抗生素的洗脫回收率為41.7% ～109.2%。最終選擇5% （v／v）甲酸甲醇溶液作為洗脫液。

圖4 洗脫液對(duì)10 種抗生素回收率的影響（n＝3）Fig.4 Effect of eluents on the recoveries of the ten antibiotics （n＝3）

2.4 實(shí)際樣品的測(cè)定

利用本文建立的測(cè)定方法分析了制藥廢水中抗生素的殘留濃度。由表4 可知該制藥廢水中檢出的抗生素主要為巴龍霉素、核糖霉素和螺旋霉素，這3種抗生素在出口水中的質(zhì)量濃度范圍為0.95 ～125.20 μg／L；巴龍霉素與核糖霉素最終去除率分別為95.77%、99.48%。巴龍霉素和核糖霉素在水相中的去除效果好主要是因?yàn)榉肿咏Y(jié)構(gòu)中都帶有多個(gè)-NH2和-OH，這些基團(tuán)可以與鈣、鎂等金屬離子發(fā)生配位反應(yīng)，或形成氫鍵，極易與固體介質(zhì)顆粒發(fā)生吸附而從水相中去除。

由于螺旋霉素于采樣前2 天就已停產(chǎn)，導(dǎo)致其在后續(xù)處理單元?dú)埩魸舛雀?，原水中螺旋霉素的濃度遠(yuǎn)低于出口水的濃度。

由于物理和化學(xué)性質(zhì)的區(qū)別，各廢水處理環(huán)節(jié)對(duì)不同種類的抗生素的去除效果也會(huì)有所不同。化學(xué)處理-水解酸化池產(chǎn)生的大量發(fā)酵細(xì)菌和產(chǎn)乙酸菌，它們通過微生物降解作用對(duì)巴龍霉素有明顯的去除作用，去除率達(dá)66.07%。好氧池的活性污泥含有豐富的好氧細(xì)菌，能對(duì)核糖霉素進(jìn)行氧化分解，致使核糖霉素在該環(huán)節(jié)的去除率達(dá)99.06%。

表4 制藥廢水中10 種目標(biāo)抗生素的測(cè)定（n＝3）Table 4 Determination of the ten antibiotics in the water samples from pharmaceutical manufacturer wastewater treatment plants （n＝3）

3 結(jié)論

建立了固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)分析制藥廢水中10 種典型抗生素的方法，定量檢測(cè)了這些抗生素在制藥廢水處理系統(tǒng)中的濃度分布。后續(xù)工作中還將補(bǔ)充這些抗生素在不同制藥廠廢水中的殘留濃度數(shù)據(jù)，通過質(zhì)量平衡分析掌握抗生素在不同制藥廢水處理系統(tǒng)中的消除機(jī)制，探究抗生素的主要去除方法，為今后的處理工藝改造、優(yōu)化提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

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