唐春蘭， 王 莉， 程孟春， 劉欣欣， 肖紅斌*

（1. 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，中國科學(xué)院分離分析化學(xué)重點實驗室，遼寧 大連116023；2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049）

天麻是一種名貴的中藥，主治頭痛眩暈、肢體麻木、癲癇抽搐等癥［1］?，F(xiàn)代藥理證實天麻有明顯的神經(jīng)保護作用［2，3］，且神經(jīng)保護作用對于腦卒中、癲癇等多種腦血管疾病有治療意義［4］。目前，從天麻中已經(jīng)分離得到60 多種化合物［5-7］，但是對天麻神經(jīng)保護物質(zhì)基礎(chǔ)的認識仍局限于已知活性成分天麻素及其苷元等單芳環(huán)化合物［8，9］，而對天麻中的其他成分研究較少。N6-羥芐腺苷是一種從天麻藥材中分離的痕量成分，被認為有明顯的神經(jīng)保護作用，是治療神經(jīng)退行性疾病及預(yù)防神經(jīng)細胞凋亡的候選藥物。而且其神經(jīng)保護效果明顯優(yōu)于天麻中的主要活性成分天麻素［10］。另外，Zhang 等［11］報道了N6-羥芐腺苷具有鎮(zhèn)靜催眠作用，其主要是通過激活腺苷A（1）／A（2A）受體和睡眠中心——腦側(cè)室前視核（VLPO）。因此測定給藥后血漿、尿液等生物樣本中的N6-羥芐腺苷含量，對于獲取天麻相關(guān)制劑的藥代動力學(xué)參數(shù)以及指導(dǎo)合理用藥具有重要意義。Lei 等［12］報道了N6-羥芐腺苷在血中及尿中原型成分及代謝產(chǎn)物的定性研究。對于N6-羥芐腺苷的血藥濃度檢測及其藥代動力學(xué)研究尚未見報道。

目前，生物樣品檢測的方法主要有高效液相色譜法（HPLC）［13，14］、氣相色譜-質(zhì)譜法（GCMS）［15，16］和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS／MS）［17，18］。實際應(yīng)用中，多采用LC-MS／MS 方法。因為LC-MS／MS 可以對生物樣中的待測物同時進行定性和定量分析，而且方法靈敏度高，準確度好，分析速度快。本研究建立了測定大鼠血漿中N6-羥芐腺苷的超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜（UPLC-MS／MS）分析方法，并應(yīng)用于N6-羥芐腺苷的血藥濃度檢測及藥代動力學(xué)研究。

1 實驗部分

1.1 藥品與試劑

N6-羥芐腺苷（見圖1）對照品（純度大于98%）和N6-二羥乙基腺苷由本實驗室合成分離得到；6-芐氨基嘌呤和6-氯嘌呤核苷購自大連美侖生物科技有限公司；乙腈、甲醇、乙酸和甲酸皆為色譜純，購自美國Sigma 公司；肝素鈉購自美國Sigma 公司。實驗用水為去離子純化水。

圖1 N6-羥芐腺苷的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of N6-（4-hydroxybenzyl）adenine riboside

1.2 儀器

Agilent 1290 高效液相色譜儀，配Agilent 6520四極桿飛行時間質(zhì)譜儀（德國Agilent 公司）；Sigma-16K 高速離心機（美國Sigma 公司）；Mettler AE 240 天平（梅特勒托利多儀器有限公司）；Milli-Q 純水機（美國Millipore 公司）。

1.3 溶液的配制

N6-羥芐腺苷標準儲備液：精密稱取N6-羥芐腺苷對照品10 mg 于10 mL 容量瓶中，用50% （v／v）甲醇水溶液溶解、定容，得1 mg／mL 標準儲備液。

內(nèi)標溶液：精密量取6-芐氨基嘌呤適量，用甲醇溶解并稀釋至200 ng／mL，備用。

1.4 實驗動物及樣品采集

SD 大鼠，體重（200±20）g，購自大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，合格證號為SCXX（遼）2008-0002。實驗動物給藥前禁食24 h，自由給水。大鼠灌胃200 mg／kg 的N6-羥芐腺苷混懸液前及后0.42、0.75、1、2、4、8、12、24 h 分別于眼底靜脈取血并置于含有抗凝劑肝素鈉的離心管中，于3 000 r／min 離心10 min，取上清液于-80 ℃低溫冰箱保存。

1.5 樣品處理

取100 μL 血漿樣品，加入4 倍體積的含1%（v／v）乙酸的乙腈沉淀蛋白質(zhì)，渦旋1 min，于12 000 r／min 離心10 min，取上清液至離心管中，50℃下氮氣吹干，殘渣用100 μL 50% （v／v）甲醇水溶液復(fù)溶，供UPLC-MS／MS 測定。

1.6 UPLC-MS／MS 條件

UPLC 條件：色譜柱為Agilent ZORBAX SBC18（150 mm×3 mm，1.8 μm）；柱溫為60 ℃；流動相為0.2% （v／v）甲酸水溶液（A）和乙腈（B）；梯度洗脫程序為0 ～5 min，15% B ～40% B；流速為0.35 mL／min；進樣量為20 μL。

MS／MS 條件：電噴霧離子（ESI）源，正離子模式；干燥氣溫度為350 ℃，干燥氣流速為9 L／min；采集范圍為m／z 50 ～750；采集頻率為1.02 spectra／s；霧化氣壓力為0.31 MPa；毛細管電壓為3 500 V；碎裂電壓為150 V；二級碎裂能量為25 eV。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

比較了水-乙腈、0.2% （v／v）甲酸水溶液-乙腈、水-甲醇、0.2% （v／v）甲酸水溶液-甲醇流動相體系。結(jié)果表明，0.2% （v／v）甲酸水溶液-乙腈體系下待測物的峰形好且靈敏度高。對10 ng／mL 的N6-羥芐腺苷標準溶液分別進行正、負離子掃描，結(jié)果表明待測物在正離子模式下的響應(yīng)明顯高于負離子模式。最后對干燥氣溫度、流速、毛細管電壓、采集頻率進行了優(yōu)化，使待測物的響應(yīng)最大。另外，對內(nèi)標進行了考察，分別以N6-二羥乙基腺苷、6-氯嘌呤核苷和6-芐氨基嘌呤為內(nèi)標進行考察，結(jié)果顯示6-芐氨基嘌呤與待測物得到很好的分離，且回收率高。因此選擇6-芐氨基嘌呤作為內(nèi)標。

2.2 定量分析

圖2 為空白大鼠血漿、血漿加標準品和大鼠灌胃N6-羥芐腺苷1 h 后的血漿樣品的提取離子流圖（提取質(zhì)量窗口為10 ppm），圖3 為N6-羥芐腺苷的質(zhì)譜圖。從圖2 中可看出N6-羥芐腺苷和內(nèi)標的保留時間為3.47 和4.62 min，峰形良好，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾N6-羥芐腺苷和內(nèi)標的測定。N6-羥芐腺苷及內(nèi)標的相關(guān)質(zhì)譜數(shù)據(jù)見表1。

圖2 （a）空白血漿、（b）空白血漿加標（添加25 ng／mL N6-羥芐腺苷和20 ng／mL 內(nèi)標）及（c）給藥1 h 后血漿樣品（添加20 ng／mL 內(nèi)標）的提取離子流圖Fig.2 Extracted ion chromatograms of （a）a blank plasma sample，（b）a blank plasma sample spiked with N6-（4-hydroxybenzyl ） adenine riboside （25 ng／mL）and IS （20 ng／mL）and （c）a plasma sample after dosing 1 h （spiked with IS （20 ng／mL））

2.3 標準曲線與定量限

圖3 N6-羥芐腺苷的（a）一級質(zhì)譜圖和（b）碎裂質(zhì)譜圖Fig.3 （a）MS and （b）MS／MS spectra of N6-（4-hydroxybenzyl）adenine riboside

用50% （v／v）甲醇水溶液將N6-羥芐腺苷儲備液稀釋成質(zhì)量濃度分別為2.5、5、10、20、40、80、160、320 和640 ng／mL 的系列標準溶液。離心管中加入25 μL 標準溶液和10 μL 內(nèi)標溶液，50 ℃下氮氣吹干，加入100 μL 空白大鼠血漿，渦旋混勻30 s，其他操作同1.5 節(jié)所述，制備成0.625 ～160 ng／mL的加標樣品，并進行UPLC-QTOF-MS 測定。質(zhì)控樣品的制備、處理及測定同上，質(zhì)控樣品的質(zhì)量濃度分別為5、25、100 ng／mL（低、中、高3 個濃度）。以N6-羥芐腺苷和內(nèi)標的峰面積比值的平均值（n ＝6）為Y，N6-羥芐腺苷的質(zhì)量濃度為X，得到回歸曲線Y ＝0.011 8X＋0.017 45，相關(guān)系數(shù)r＞0.99。檢出限（S／N＝3）為0.1 ng／mL。

2.4 準確度和精密度

用空白大鼠血漿配制低、中、高3 個質(zhì)量濃度（同質(zhì)控樣品）的樣品各5 份，連續(xù)測定5 天，考察日內(nèi)與日間精密度（以RSD 計）和準確度（以RE 計，RE ＝（測定濃度-加標濃度）／加標濃度×100% ）。結(jié)果表明，3 個質(zhì)量濃度的日內(nèi)與日間的RSD 均小于6%，RE 低于±15% （見表2），滿足生物樣品分析要求。

表1 N6-羥芐腺苷及內(nèi)標的UPLC-MS／MS 參數(shù)Table 1 UPLC-MS／MS information of N6-（4-hydroxybenzyl）adenine riboside and IS

表2 空白大鼠血漿中N6-羥芐腺苷的日內(nèi)、日間精密度和準確度Table 2 Intra-and inter-day precisions and accuracies of N6-（4-hydroxybenzyl）adenine riboside in a blank rat plasma sample

2.5 回收率和基質(zhì)效應(yīng)

回收率為空白血漿中加入藥物經(jīng)提取后的藥物響應(yīng)值與空白血漿處理后加入相同量藥物后藥物響應(yīng)值的比值；基質(zhì)效應(yīng)為具有基質(zhì)的標準品與純標準品的藥物響應(yīng)值的比值。用空白大鼠血漿配制低、中、高3 個質(zhì)量濃度（同質(zhì)控樣品，n ＝5）的大鼠血漿樣品進行測定。N6-羥芐腺苷在低、中、高3 個質(zhì)量濃度的回收率為88.41% ～108.26%，符合生物樣品分析的要求；基質(zhì)效應(yīng)為95.54% ～109.48%，因此可忽略基質(zhì)效應(yīng)的影響。結(jié)果見表3。

表3 空白大鼠血漿中N6-羥芐腺苷的加標回收率和基質(zhì)效應(yīng)（n＝5）Table 3 Recoveries and matrix effect of N6-（4-hydroxybenzyl ） adenine riboside spiked in blank rat plasma （n＝5）

2.6 穩(wěn)定性考察

用空白大鼠血漿配制低、中、高3 個濃度（同質(zhì)控樣品，n ＝5）的大鼠血漿樣品，分別考察不同條件下樣品的穩(wěn)定性：在-80 ℃冰箱中保存30 天（長期穩(wěn)定性）、室溫放置6 h（短期穩(wěn)定性）、反復(fù)凍融3次（凍融穩(wěn)定性）及處理后的樣品在進樣器中放置24 h（制備后穩(wěn)定性）。結(jié)果（見表4）表明，樣品中N6-羥芐腺苷在上述條件下穩(wěn)定性良好。

表4 不同條件下大鼠血漿中N6-羥芐腺苷的穩(wěn)定性Table 4 Stabilities of N6-（4-hydroxybenzyl）adenine riboside in rat plasma under different conditions

2.7 N6-羥芐腺苷的藥代動力學(xué)研究

應(yīng)用本文建立的UPLC-QTOF-MS 方法測定了大鼠灌胃N6-羥芐腺苷后血漿中N6-羥芐腺苷的含量。其平均血藥濃度-時間曲線見圖4，相應(yīng)的藥代動力學(xué)參數(shù)見表5?？梢钥闯?，大鼠灌胃N6-羥芐腺苷后1.15 h 達到峰值（107.53 ng／mL），且N6-羥芐腺苷的半衰期為7.75 h。

圖4 大鼠灌胃200 mg／kg N6-羥芐腺苷后的平均血藥濃度-時間曲線（n＝6）Fig.4 Mean plasma concentration-time profile for N6-（4-hydroxybenzyl）adenine riboside after intragastric administration of 200 mg／kg N6-（4-hydroxybenzyl）adenine riboside in rats （n＝6）

表5 大鼠血漿中N6-羥芐腺苷的藥代動力學(xué)參數(shù)Table 5 Pharmacokinetic parameters of N6-（4-hydroxybenzyl）adenine riboside in rat plasma

3 結(jié)論

本實驗建立了測定大鼠血漿樣品中N6-羥芐腺苷的超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜分析方法。通過方法學(xué)驗證和實際應(yīng)用，證明該方法靈敏度高、重復(fù)性好、快速簡便，適用于N6-羥芐腺苷血藥濃度的測定及其藥代動力學(xué)研究，為其臨床藥代動力學(xué)、藥效學(xué)研究提供參考。

［1］ Zheng H Z，Dong Z H，She J. Research and Application in Modernization of Chinese Medicine，Volume 1. Beijing：Academy Press （鄭虎占，董澤宏，佘靖. 中草藥現(xiàn)代研究與應(yīng)用，第1 卷. 北京：學(xué)苑出版社），1997

［2］ Sun X F，Wang W，Wang D Q，et al. China Journal of Chinese Materia Medica （孫曉芳，王巍，王丹巧，等. 中國中藥雜志），2004，29（4）：292

［3］ Ramachandran U，Manavalan A，Sundaramurthi H，et al.Neurochem Int，2012，60（8）：827

［4］ Zhang T，Cao X L. Chinese Journal of Integrative Medicine on Cardio-／Cerebrovascular Disease （張濤，曹曉嵐. 中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志），2007，5（6）：515

［5］ Wang L，Xiao H B，Liang X M，et al. J Sep Sci，2007，30（10）：1488

［6］ Wang L，Xiao H B，Yang L，et al. J Asian Nat Prod Res，2012，14（5）：457

［7］ Wang L，Xiao H B，Liang X M. Chinese Traditional and Herbal Drugs （王莉，肖紅斌，梁鑫淼. 中草藥），2009，40（8）：1186

［8］ Wang Q Z. Chinese Journal of Trauma and Disability Medicine （王乾忠. 中國傷殘醫(yī)學(xué)），2013，21（11）：223

［9］ Hu Y K，Li C Y，Shen W. Neuropathology，2014，34（4）：370

［10］ Huang N K，Chern Y J，F(xiàn)ang J M，et al. J Nat Prod，2007，70（4）：571

［11］ Zhang Y，Li M，Kang R X，et al. Pharmacol Biochem Be，2012，102：450

［12］ Lei Y J，Wang L，Cheng M C，et al. Biomed Chromatogr，2011，25（3）：344

［13］ Chen X Z，Chen W Q，Wang J，et al. Chinese Journal of Chromatography （陳小珍，陳萬勤，王瑾，等. 色譜），2013，31（9）：875

［14］ Tang C L，Wang L，Cheng M C，et al. J Chromatogr B，2014，973：104

［15］ Huang H Q，Huang X，Yu J S. Chinese Journal of Chromatography （黃會秋，黃遜，余驚筍. 色譜），2015，33（3）：323

［16］ Qiu Z L，Lin Y，Xiong Z L，et al. Chinese Journal of Chromatography （丘忠麗，林纓，熊志立，等. 色譜），2014，32（7）：779

［17］ Xiong S，Li J L，Zhu X Q，et al. Chinese Journal of Chromatography （熊山，李敬來，朱秀清，等. 色譜），2014，32（3）：290

［18］ Li Y J，Zhang C L，Zhang H，et al. Chinese Journal of Chromatography （李艷杰，張春蘭，張晗，等. 色譜），2014，32（5）：464