黃克建 ， 盧敏萍， 周 哲， 林翠梧， 楊 寧， 劉曉鋒， 朱定姬，梁 平， 喬文濤， 李宏森， 李 璐， 黃曉青

（1. 廣西壯族自治區(qū)公安廳物證鑒定中心，廣西 南寧530012；2. 廣西大學化學化工學院，廣西 南寧530004；3. 賽默飛世爾科技（中國）有限公司，上海201206；4. 廣西壯族自治區(qū)職業(yè)病防治研究院，廣西 南寧530021）

抗凝血殺鼠藥是目前廣泛使用的一類慢性殺鼠藥，由4-羥基香豆素或茚二酮母體結(jié)構(gòu)衍生而來［1］。抗凝血殺鼠藥進入機體后，會拮抗維生素K1的活性，抑制肝臟產(chǎn)生凝血酶原及凝血因子，使凝血酶失去活性，同時提高毛細血管通透性和脆性，因而造成各臟器及黏膜大面積出血而死亡［2］。與急性殺鼠藥如毒鼠強相比，該類慢性殺鼠藥由于具有廣譜、高效、適口性好、毒性相對較低、不易引起二次中毒且有特效解毒藥維生素K1 等特點，廣泛應用于室內(nèi)和野外殺鼠工作［3］。由于這類藥物比較容易獲得，近年來人、家畜、野生動物等中毒情況時有發(fā)生。目前，檢測生物樣品中抗凝血殺鼠藥已成為公安機關(guān)刑事技術(shù)部門日常主要任務之一。因此，建立一種快速檢測血液和尿液中抗凝血殺鼠藥的方法，可為中毒者對癥治療、公安機關(guān)立案偵破及訴訟提供科學依據(jù)。

目前，抗凝血殺鼠藥的檢測方法主要有薄層色譜法（TLC）、紫外-可見分光光度法（UV-Vis）、氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）［3，4］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）［5］和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS／MS）［6-16］。TLC 和UV-Vis 檢測靈敏度低，難以滿足檢測要求；GC 和GC-MS 前處理耗時長，衍生化過程復雜，且抗凝血殺鼠藥通常相對分子質(zhì)量較大，部分甚至含有羥基，不易氣化，不宜用GC 和GC-MS 分析；HPLC 可以準確檢測μg／mL、μg／g 級的樣品，但以色譜保留時間作為唯一定性指標缺乏足夠的選擇性，可能會導致假陽性結(jié)果［1］。而LC-MS／MS 則結(jié)合了色譜分離與質(zhì)譜結(jié)構(gòu)確證的優(yōu)勢，樣品前處理無須衍生化，可選擇多級離子掃描檢測，能同時進行多組分的定性確證和定量分析，具有靈敏度高、檢出限低的優(yōu)點，因此廣泛應用于抗凝血殺鼠藥的檢測中。由于尿液、血樣、組織等生物樣品的基質(zhì)成分復雜，蛋白質(zhì)等基質(zhì)成分嚴重影響定性和定量結(jié)果；且樣品中的鹽不但會干擾質(zhì)譜分析的離子化過程，還會污染離子源，使靈敏度大大降低［17］。因此，在應用LC-MS／MS 進行定性與定量分析時，一般需要進行樣品前處理，這是極為重要的環(huán)節(jié)，也常是最耗時、最困難的工作［18］?，F(xiàn)有的抗凝血殺鼠藥樣品前處理方法通常采用蛋白質(zhì)沉淀法［3］、液液萃取法［4，5，8-13］和離線固相萃取法（offline SPE）［6，7，14-16］等。這些方法均可起到富集、減少基質(zhì)干擾的作用，但存在操作繁瑣、步驟多、耗材成本高、重現(xiàn)性差、低通量等問題。與傳統(tǒng)的液液萃取、離線固相萃取相比，近年發(fā)展起來的在線固相萃取（on-line SPE）技術(shù)顯著簡化了樣品前處理工作，因具有自動化程度高、富集效果好、樣品損耗低、SPE 柱可重復使用等優(yōu)點，近年來在藥物分析、食品安全、環(huán)境科學等諸多領(lǐng)域得到廣泛的應用［18-20］。目前，尚未見關(guān)于抗凝血殺鼠藥的在線固相萃取前處理方法的報道。

本研究建立了在線固相萃?。合嗌V-線性離子阱質(zhì)譜（on-line SPE／LC-LIT／MS）快速檢測血液、尿液中克滅鼠、殺鼠靈、殺鼠醚、敵鼠、氯敵鼠、溴敵隆和大隆7 種抗凝血殺鼠藥的分析方法，為中毒案（事）件的抗凝血殺鼠藥的快速篩查提供科學依據(jù)和技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

DionexTMUltimate 3000TM雙三元液相色譜系統(tǒng)（美國賽默飛世爾科技有限公司），配備DGP-3600SD 脫氣機、TCC-3000SD 柱溫箱（帶六通閥）、WPS-3000TFC-ANALYTICAL 自動進樣器、MWD-3000 紫外檢測器。質(zhì)譜系統(tǒng)：LTQ XLTM型線性離子阱質(zhì)譜儀（美國賽默飛世爾科技有限公司），配加熱電噴霧離子源（HESI-II）、XcaliburTM數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、Mass Frontier 7.0TM軟件。3-18R 高速冷凍離心機（美國TOMOS 公司）；SB 3200-HT 超聲波清洗器（必能信上海有限公司）；Master-s UV 超純水發(fā)生器（上海和泰儀器有限公司）。

克滅鼠（coumafuryl，純度99.0%）、殺鼠醚（coumatetralyl，純度99.9%）、殺鼠靈（warfarin，純度97.2%）、敵鼠（diphacinone，純度98.0%）、氯敵鼠（chlorophacinone，純度98.9%）、溴敵隆（bromoadiolone，純度93.6%）和大?。╞rodifacoum，純度99.3%）標準品購自美國Sigma 公司；甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨為色譜純（美國Fisher 公司）；實驗用水為超純水。

分別準確稱取7 種標準品，用乙腈溶解定容，配制成200 μg／mL 的單標準儲備液，于-15 ℃下保存。使用時根據(jù)需要用乙腈稀釋，配制成不同質(zhì)量濃度的單標準工作液和混合標準工作液。

1.2 在線固相萃取和色譜條件

在線SPE 柱：Waters Oasis?HLB（20 mm×3.9 mm，15 μm）。左泵為在線固相萃取泵，流動相A：水；流動相B：甲醇。分析柱：Dionex AcclaimTMRSLC 120 C18（100 mm×3.0 mm，2.2 μm）。右泵為分析泵，流動相A：0.02 mol／L 乙酸銨溶液；流動相B：甲醇。柱溫40 ℃；進樣量50 μL；梯度洗脫條件及六通閥切換程序見表1，on-line SPE／HPLCMS 流路圖見圖1。

表1 梯度洗脫條件及六通閥切換程序Table 1 Gradient elution and valve switching programs

圖1 在線固相萃?。合嗌V-線性離子阱質(zhì)譜的流路圖Fig.1 Diagram of on-line SPE／HPLC-MS

1.3 質(zhì)譜條件

電離方式為ESI 負離子模式；噴霧電壓為4 000 V；棱鏡電壓為85 V；氮氣作為鞘氣和輔助氣，其中鞘氣35 arb；輔助氣15 arb；氦氣用作碰撞氣；離子源溫度為300 ℃；毛細管溫度為350 ℃；隔離窗口為2 amu；采用保留時間鎖定目標化合物二級子離子全掃描方式，分別記錄7 種抗凝血殺鼠藥的二級子離子數(shù)據(jù)。保留時間鎖定窗口見圖2，主要質(zhì)譜參數(shù)見表2。

1.4 樣品處理

吸取0.5 mL 全血和尿液，分別置于10 mL 試管中，再分別加入1 mL 乙腈，然后渦旋振蕩1 min，隨后分別加入3.5 mL 乙酸銨水溶液（0.02 mol／L），超聲提取5 min 后在10 000 r／min 的轉(zhuǎn)速下離心5 min，上清液過0.22 μm 濾膜，供LC-MS分析。

表2 7 種抗凝血殺鼠藥的主要質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Main MS parameters of the seven anticoagulant rodenticides

圖2 7 種抗凝血殺鼠藥同時分析時的采集時間窗口Fig.2 Data acquisition time window for simultaneous analysis of the seven anticoagulant rodenticides

2 結(jié)果與討論

2.1 在線SPE 條件的優(yōu)化

選用合適的在線SPE 柱和設(shè)計合理的富集凈化和洗脫條件，是在線SPE 方法的關(guān)鍵［19］。本方法選用Waters Oasis?HLB 柱作為在線SPE 柱，該柱為反相保留機理，對酸性、中性和堿性化合物均具有吸附作用，富集效果好，是一種通用型萃取柱?？疾炝碎y切換時間對萃取的影響，用SPE 柱代替分析柱直接與質(zhì)譜檢測器連接，以水為流動相，結(jié)果樣品中基質(zhì)流出SPE 柱所需的時間為3 min，閥切換時間應晚于該時間，因此選擇在4 min 時將閥由1_2切換至6_1 狀態(tài)，既有效除去基質(zhì)干擾，又保證了目標分析物有較高的萃取效率。

另外考察了分析柱流動相中有機相的初始比例對目標物洗脫和分離的影響。有機相初始比例高，可以將目標物快速轉(zhuǎn)移至分析柱，但目標物在短時間內(nèi)集中流出，不利于分離。實驗最終選擇40% 的有機相初始比例，既可以有效避免色譜峰展寬問題，提高響應值，又可以使7 種殺鼠藥得到較好的分離。

2.2 分析柱的選擇

抗凝血殺鼠藥主要包括茚滿二酮類和4-羥基香豆素類兩種，其中敵鼠、氯敵鼠屬于前者，含有多個羰基構(gòu)成的酰亞胺結(jié)構(gòu)；溴敵隆、溴鼠靈、克鼠靈、殺鼠醚和殺鼠靈屬于后者，含有α，β-不飽和羰基及羥基，因此這7 種殺鼠藥均為弱酸性化合物，并有一定的極性。

考察了Hypersil GOLD C8、Hypersil GOLD C18 和AcclaimTMRSLC 120 C18 型分析柱對7 種殺鼠藥的保留作用，通過分析比較峰形、分離效果和響應值，最終選擇AcclaimTMRSLC 120 C18 作為分析柱，7 種殺鼠藥的提取離子色譜圖見圖3。

圖3 7 種殺鼠藥的提取離子色譜圖Fig.3 Extracted ion chromatograms of the seven anticoagulant rodenticides

2.3 流動相的選擇

樣品中分析物的保留行為是分析物與固定相、流動相相互作用的結(jié)果，因此流動相選擇適當與否對分析物的分離尤其重要。對乙腈-乙酸銨水溶液和甲醇-乙酸銨水溶液兩種體系進行了考察，在相同條件下，采用甲醇-乙酸銨水溶液為分析流動相時，7種殺鼠藥的響應值明顯更高。以甲醇-乙酸銨水溶液為流動相，考察了甲酸對檢測結(jié)果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流動相中甲酸體積分數(shù)為0.05% ～0.1% 時，7種殺鼠藥的峰形較寬，且均出現(xiàn)了不同強度的［MH＋68］-峰，推測為目標物與甲酸鈉（HCOONa）結(jié)合形成的，其中敵鼠和氯敵鼠最為明顯，不但拖尾嚴重，還出現(xiàn)了較強的［M-H＋68］-峰；而流動相不含甲酸時，7 種殺鼠藥色譜峰形對稱，［M-H＋68］-峰消失，且敵鼠和氯敵鼠的［M-H］-響應值比含甲酸情況下提高了10 倍以上?？赡茉蚴? 種殺鼠藥均為弱酸性化合物，其在酸性流動相中形成分子態(tài)，不利于色譜分離和質(zhì)譜檢測，當流動相不加甲酸時，pH 高于分析物的pKa2 個單位以上，有利于色譜分離和提高分析物的離子化效率，7 種殺鼠藥的pKa值見表3。根據(jù)實驗結(jié)果，最終選擇甲醇和0.02 mol／L 乙酸銨水溶液為流動相。

表3 7 種抗凝血殺鼠藥的pKa 值Table 3 pKa values of the seven anticoagulant rodenticides

2.4 基質(zhì)溶液酸堿性對萃取效率的影響

比較了基質(zhì)溶液pH 值分別為4.8、7.0 和9.2時7 種抗凝血殺鼠藥的萃取效果。結(jié)果表明，在不同pH 值下均能萃取到7 種抗凝血殺鼠藥，總體來說酸性和中性條件下萃取效果比較好，堿性條件下雖然也能獲得較好的萃取效果，但重現(xiàn)性較差。結(jié)合流動相考慮，最終選取0.02 mol／L 乙酸銨水溶液（pH 7.0）為樣品的稀釋液?；|(zhì)酸堿性對萃取效率的影響見圖4。

2.5 乙腈加入量對萃取效率的影響

圖4 基質(zhì)溶液pH 對萃取效率的影響Fig.4 Influence of pH value of matrix solution on extraction efficiency

血液和尿液樣品用SPE 處理時，常需加入有機溶劑來沉淀蛋白質(zhì)，以降低堵塞SPE 柱的風險。選取乙腈為蛋白沉淀劑，考察了基質(zhì)溶液中乙腈的體積分數(shù)對萃取效率的影響。結(jié)果如圖5 所示，基質(zhì)溶液中乙腈的體積分數(shù)為5% ～45% 時均能萃取到藥物，綜合考慮后選擇添加20% 乙腈。

圖5 乙腈含量對萃取效率的影響Fig.5 Influence of volume percentage of acetonitrile on extraction efficiency

2.6 定量離子的選擇

本研究采用從二級全掃描信號中提取子離子進行定量的方式，故二級離子的選擇對定量結(jié)果有重要的影響。對碎裂機理進行研究，選擇高靈敏度和高專屬性的碎片作為定量離子。香豆素類抗凝血殺鼠藥一個較為常見的碎片為香豆素基團形成的m／z 161 碎片，該碎片是克滅鼠和殺鼠靈的優(yōu)勢碎片，故選擇m／z 161 為兩者的定量離子；殺鼠醚、大隆的優(yōu)勢碎片都是脫去O-C＝O 基團、中性丟失44 后形成的碎片離子，故分別選擇m／z 247 和m／z 477 為兩者的定量離子；溴敵隆因存在獨立羥基，優(yōu)勢碎片是由脫O-C＝O 和脫H2O 共同形成的m／z 463，選擇其作為定量離子。茚二酮基團形成的m／z 145 離子是茚二酮類抗凝血殺鼠藥形成的主要碎片之一，在敵鼠和氯敵鼠的二級質(zhì)譜圖中均可觀察到響應較高的m／z 145 峰，但這兩個化合物的優(yōu)勢碎片是乙?；鶖嗔押笥啥交鶊F形成的離子，這可能與二苯基可以更好地共軛電子有關(guān)，故分別選擇m／z 167 和m／z 201 為兩者的定量離子。各藥物的二級質(zhì)譜圖及裂解方式見圖6。

圖6 7 種抗凝血殺鼠藥的二級質(zhì)譜圖及裂解方式Fig.6 MS2and fragmentation patterns of the seven anticoagulant rodenticides

2.7 自建數(shù)據(jù)庫定性確證

在Mass Frontier 7.0 的Database Manager 中建立7 種抗凝血殺鼠藥的液相色譜-線性離子阱質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，庫中包括化合物名稱、分子式、相對分子質(zhì)量、CAS 登錄號、結(jié)構(gòu)式、二級質(zhì)譜圖和保留時間等信息。進行定性檢索時采用聯(lián)合組分檢測（Joint Components Detection）算法，對樣品數(shù)據(jù)中的組分進行查找?；谒须x子輪廓圖最大值的統(tǒng)計分析，通過提取各個質(zhì)譜峰豐度輪廓圖，可創(chuàng)建出樣品中化合物的純凈質(zhì)譜樹，生成相應的峰形，并自動與庫中化合物的母離子、碎片離子和保留時間等信息匹配。在沒有標準品的情況下，也能夠通過本方法實現(xiàn)對樣品的快速準確定性篩查。該數(shù)據(jù)庫為開放體系，可在后續(xù)工作過程中不斷增加目標化合物至數(shù)據(jù)庫中，為應用的進一步拓展提供了前景。

2.8 方法的線性范圍和檢出限

在空白血液和尿液中添加7 種抗凝血殺鼠藥的混合標準工作溶液，得到0.10 ～1 000 ng／mL 系列樣品，按1.4 節(jié)方法進行處理。以目標分析物的質(zhì)量濃度C（ng／mL）為橫坐標，峰面積A 為縱坐標，繪制7 種殺鼠藥的標準工作曲線。采用逐步稀釋法進行測試，以信噪比（S／N）≥3 確定檢出限（LOD），以S／N≥10 確定定量限（LOQ）。7 種殺鼠藥的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限等結(jié)果見表4。

表4 7 種抗凝血殺鼠藥的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)（r2）、檢出限和定量限Table 4 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients （r2），limits of detection （LODs）and limits of quantification （LOQs）of the seven anticoagulant rodenticides

2.9 方法的加標回收率及精密度

在空白血液和尿液中分別添加不同量的混合標準溶液，配制成低、中、高3 個濃度水平的加標溶液，按1.4 節(jié)方法進行處理，每個濃度水平均平行測定6 次，考察方法的精密度和回收率（見表5）。

表5 全血和尿液中7 種抗凝血殺鼠藥的加標回收率和精密度（n＝6）Table 5 Recoveries and precisions of the seven anticoagulant rodenticides in whole blood and urine samples （n＝6）

3 結(jié)論

建立了快速測定血液、尿液中7 種抗凝血殺鼠藥的在線固相萃?。合嗌V-線性離子阱質(zhì)譜檢測方法。樣品經(jīng)乙腈沉淀蛋白質(zhì)，稀釋、離心和過濾后即可直接進樣，與傳統(tǒng)的離線SPE 相比較，在線SPE 具有速度快、成本低、能自動化分析等優(yōu)點，克服了使用離線SPE 帶來的成本高、費時費力等缺點，大大提高了檢測通量。相較于傳統(tǒng)三維離子阱，二維線性離子阱內(nèi)的離子沿線性方向聚集，有效降低了空間電荷效應，大大提升了阱內(nèi)離子容量，具備同時定性定量的能力；利用線性離子阱的這種性能，采用二級全掃描確證和子離子定量的方法，一針進樣即可實現(xiàn)同時定性定量分析。該方法操作簡便快速、結(jié)果準確、重現(xiàn)性好、靈敏度高，非常適合血液、尿液樣品中抗凝血殺鼠藥的篩查與確證。

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