劉曉燕， 劉艷秋， 程孟春， 肖紅斌，3*

（1. 中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，中國(guó)科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連116023；2. 大連醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院（研究院），遼寧 大連116044；3. 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京100029）

肝臟是藥物在體內(nèi)代謝的最主要場(chǎng)所，藥物在此進(jìn)行聚合、氧化、還原、羥化以及去甲基化等一系列的代謝過程，從而在全身諸個(gè)臟器發(fā)揮效應(yīng)，可想而知，肝臟是最容易遭受藥物影響的臟器。藥物誘導(dǎo)的肝損傷是許多藥物被迫撤出市場(chǎng)的主要原因［1，2］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在已上市應(yīng)用的化合性或生物性藥物中，有1 100 種以上的藥物具有潛在的肝毒性，很多藥物的賦形劑、中草藥以及保健藥亦有導(dǎo)致肝損傷的可能［3］。迄今為止，藥物肝損傷的早期診斷仍是臨床工作者的一大難題，其發(fā)生、發(fā)展機(jī)制至今也尚未闡明，迫切需要新型肝毒性標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)。代謝組學(xué)能夠反映機(jī)體對(duì)病理、生理及基因改變引起的代謝變化，在疾病診斷［4，5］、病理學(xué)［6］、藥物安全性評(píng)價(jià)［7］等臨床研究方面顯示出明顯的優(yōu)勢(shì)。應(yīng)用代謝組學(xué)有助于發(fā)現(xiàn)在藥物肝損傷早期發(fā)生顯著變化的標(biāo)志性代謝物。

本研究旨在應(yīng)用細(xì)胞代謝組學(xué)技術(shù)揭示不同類型藥物肝損傷的代謝譜，進(jìn)而篩選肝毒性相關(guān)差異代謝物。通過對(duì)內(nèi)源性代謝物的表征能夠找出與藥物肝損傷相關(guān)的代謝通路，有助于指導(dǎo)肝損傷的治療［8］。四氯化碳是公認(rèn)的化學(xué)類肝臟毒物。相關(guān)的研究工作發(fā)現(xiàn)，在四氯化碳誘發(fā)的肝損傷中，機(jī)體的膽汁酸代謝、脂肪酸代謝和能量代謝發(fā)生了紊亂［9-11］。對(duì)乙酰氨基酚（APAP）誘導(dǎo)的肝損傷是西藥肝損傷的經(jīng)典模型，通常作為肝損傷研究的陽性對(duì)照模型［8］。大量的研究顯示APAP 可以干擾肝臟正常的氨基酸代謝和脂質(zhì)代謝［12-14］。大黃素、雷公藤甲素和馬兜鈴酸是中藥的主要活性成分，具有多種藥理作用。然而，近年來關(guān)于其引起肝損傷的報(bào)道屢見報(bào)端［15，16］，但對(duì)于其肝損傷的機(jī)制仍存在爭(zhēng)議。

本研究以人源性正常肝細(xì)胞HL7702 為模型，利用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-MS）技術(shù)對(duì)以上藥物誘導(dǎo)的肝損傷細(xì)胞模型進(jìn)行代謝輪廓分析，應(yīng)用模式識(shí)別構(gòu)建分類模型，篩選、鑒定并驗(yàn)證與肝毒性相關(guān)的差異代謝物，結(jié)合代謝通路進(jìn)行相關(guān)討論。本研究為藥源性肝損傷新型標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)及肝毒性早期診斷提供了參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

試劑：人源性正常肝細(xì)胞（HL7702，上海和園生物技術(shù)有限公司）。甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó)Sigma-Aldrich 公司）。甲酸（色譜純，天津科密歐公司）。RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Gibco 公司）。3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）、胰蛋白酶和蛋白定量試劑盒（北京索萊寶公司）。馬兜鈴酸（CAS No. 313-67-7，純度98%，批號(hào)140416，中國(guó)食品藥品檢定研究所），對(duì)乙酰氨基酚（CAS No. 103-90-2，純度99.0%，批號(hào)l1318049）和四氯化碳（光譜純，批號(hào)112044，上海阿拉丁公司）。聯(lián)苯雙酯（DDB，純度99.0%，批號(hào)100192-200503）、大黃素（CAS No.518-82-1，純度98%，批號(hào)0756-200110）和雷公藤甲素（CAS No. 38748-32-2，純度98%，批號(hào)111567-201404）（中國(guó)食品藥品檢定研究所）。超純水由Milli-Q 純化系統(tǒng)（美國(guó)Millipore 公司）制備。

儀器：高速離心機(jī)（美國(guó)Sigma-Aldrich 公司）；Sunrise 酶標(biāo)儀（瑞士帝肯公司）；離心濃縮干燥器（美國(guó)Thermo 公司）。Mini-Beadbeater 16.0（美國(guó)Biospec 公司）。Agilent 1290 Infinity 超高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）。Agilent 6520 四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（Quadrupole time-of-flight mass spectrometry，Q-TOF-MS，美國(guó)Agilent 公司）。色譜柱為Zorbax Eclipse plus C18 柱（150 mm×3.0 mm，1.8 μm，美國(guó)Agilent 公司）。

1.2 細(xì)胞活性檢測(cè)

HL7702 細(xì)胞置于含10% 胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，每1 ～2 天換液一次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用胰蛋白酶消化細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以每孔105個(gè)細(xì)胞接種到96 孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，藥物組分別加入用新鮮培養(yǎng)基配制的系列濃度梯度的APAP、四氯化碳、大黃素、雷公藤甲素、馬兜鈴酸和雷公藤甲素-聯(lián)苯雙酯溶液，各濃度設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，共培養(yǎng)48 h。對(duì)照組加入完全培養(yǎng)基，空白組不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)基。采用MTT染色，酶標(biāo)儀于570 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)各孔的光密度值（OD）。以細(xì)胞抑制率＝（對(duì)照組OD-藥物組OD）／（對(duì)照組OD-空白組OD）×100% 計(jì)算細(xì)胞抑制率。

1.3 代謝組學(xué)樣品處理

按照1.2 節(jié)方法，將細(xì)胞以每孔2×106個(gè)細(xì)胞接種到6 孔板中，過夜后，分別加入擬定濃度的APAP、四氯化碳、大黃素、雷公藤甲素、馬兜鈴酸和雷公藤甲素-聯(lián)苯雙酯溶液，共培養(yǎng)48 h 建立肝損傷模型。平行設(shè)置對(duì)照組，每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔。棄掉培養(yǎng)基，用50 mmol／L PBS 緩沖液淋洗3 次，用細(xì)胞刮輕輕刮取細(xì)胞樣品，以1 000 r／min 離心5 min 獲得細(xì)胞餅，儲(chǔ)存于-80 ℃超低溫冰箱中。

胞內(nèi)代謝物提取方法在文獻(xiàn)［17］報(bào)道方法的基礎(chǔ)上稍作修改。采用200 μL 80% 冷甲醇水溶液（-80 ℃）淬滅細(xì)胞，用Mini-Beadbeater 勻質(zhì)機(jī)裂解細(xì)胞，參數(shù)如下：勻質(zhì)1 min，間隔20 s，重復(fù)勻質(zhì)1 min。裂解液于12 000 r／min 離心10 min，取上清液，真空抽干，復(fù)溶于100 μL 5% （v／v）乙腈水溶液。樣品沉淀蛋白采用蛋白定量試劑盒定量，方法按照說明書進(jìn)行。總蛋白定量用于校正樣本間由細(xì)胞數(shù)目差異引起的代謝物變化。同時(shí)吸取各樣本20 μL 混勻制成質(zhì)控樣本，用于監(jiān)測(cè)儀器的穩(wěn)定性。所有復(fù)溶后的樣本儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱中，待檢測(cè)。

1.4 UPLC-QTOF-MS 分析

色譜系統(tǒng)參數(shù)：柱溫為50 ℃。流動(dòng)相A 為0.1% 甲酸水溶液，流動(dòng)相B 為乙腈。洗脫梯度：0～3 min 由5% B 線性升到50% B；3 ～15 min 由50% B 線性升到100% B，保持5 min；20 ～20.1 min 由100% B 線性降至5% B 并保持5 min。

質(zhì)譜系統(tǒng)參數(shù)：毛細(xì)管電壓為3 500 V，溫度為350 ℃；進(jìn)樣錐電壓為40 V；干燥氣流速為8 L／min；霧化器壓力為0.276 MPa，采用電噴霧電離（ESI）正離子模式檢測(cè)。質(zhì)量掃描范圍為100 ～1 000 （一級(jí)質(zhì)譜）和50 ～1 000（二級(jí)質(zhì)譜）。采用Agilent 實(shí)時(shí)校正液進(jìn)行質(zhì)量實(shí)時(shí)校正，確保質(zhì)譜分析的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。樣品分析過程采用隨機(jī)進(jìn)樣的方式進(jìn)行。樣本分析前，首先進(jìn)兩針質(zhì)控樣本以穩(wěn)定系統(tǒng)。隨后，在分析過程中，每進(jìn)6 個(gè)樣本，重復(fù)進(jìn)質(zhì)控樣本一次，連續(xù)監(jiān)控系統(tǒng)的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

1.5 數(shù)據(jù)處理

將UPLC-MS 獲得的原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過在線軟件XCMS 進(jìn)行峰識(shí)別、峰對(duì)齊和峰匹配［18］。所得數(shù)據(jù)矩陣經(jīng)過80% 規(guī)則、蛋白差異校正和面積歸一化處理，然后導(dǎo)入SIMCAP 11.5 軟件進(jìn)行模式識(shí)別分析。本研究采用主成分分析（PCA）模型區(qū)別各組代謝譜差異，采用偏最小二乘法判別分析（PLSDA）模型篩選差異代謝物。通過R2X、R2Y、Q2參數(shù)值評(píng)價(jià)模型質(zhì)量，其中R2X、R2Y 越接近1 表示模型越穩(wěn)定，Q2＞0. 5 表示預(yù)測(cè)率高。

根據(jù)PLS-DA 模型得到的變量權(quán)重值（VIP）篩選潛在的肝毒性標(biāo)志物。實(shí)驗(yàn)中采用T 檢驗(yàn)驗(yàn)證代謝物差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)具有顯著差異的潛在標(biāo)志物進(jìn)行鑒定，鑒定方法借鑒已有報(bào)道［19］；首先，確定代謝物的準(zhǔn)分子離子峰；其次應(yīng)用代謝物的精確相對(duì)分子質(zhì)量檢索數(shù)據(jù)庫(kù)（http：／／metlin.scripps. edu）、HMDB （http：／／ www. hmdb.ca／）、ChemSpider （http：／／www.chemspider.com）、KEGG （http：／／ www. genome. jp）、Lipid Maps （http：／／www. lipidmaps. org），質(zhì)量偏差為10×10-6（10 ppm），由此得到多個(gè)候選物；最后由標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行驗(yàn)證或者對(duì)代謝物進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，根據(jù)二級(jí)碎片檢索質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)確定化合物結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與討論

2.1 代謝組學(xué)方法評(píng)價(jià)

為了獲得高質(zhì)量的適用于代謝組學(xué)分析的數(shù)據(jù)，本研究嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件。分析過程中，不同組的樣品隨機(jī)進(jìn)樣分析，采用XCMS 程序包檢測(cè)所有樣本保留時(shí)間的重復(fù)性，結(jié)果顯示保留時(shí)間偏差＜24 s（見圖1a），符合分析要求［20］。對(duì)質(zhì)控樣本進(jìn)行主成分分析，結(jié)果顯示質(zhì)控樣本隨時(shí)間的變化控制在±2SD 之內(nèi)（見圖1b），說明整個(gè)分析過程重復(fù)性和穩(wěn)定性良好。篩選質(zhì)控樣本中峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于30% 的變量（占總變量數(shù)的70% 以上），對(duì)其在生物樣本中的變化進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析［21］?；谝陨辖Y(jié)果，可以認(rèn)為各組之間的差異是由生物學(xué)差異而非分析方法引起的。

2.2 藥物的肝細(xì)胞毒性研究

作用48 h，藥物對(duì)HL7702 細(xì)胞的抑制率呈現(xiàn)劑量依賴的趨勢(shì)（見圖2）。隨著藥物濃度的增加，其對(duì)肝細(xì)胞的抑制率增強(qiáng)，最終達(dá)到相對(duì)最大值。根據(jù)抑制率曲線計(jì)算各藥物的半抑制濃度（IC50值），分 別 為：APAP，13 mmol／L；大 黃 素，28 μmol／L；雷公藤甲素，36 nmol／L；馬兜鈴酸，70 μmol／L。由于四氯化碳在培養(yǎng)基中的溶解度限制，其干預(yù)劑量并未達(dá)到IC50 值，但是四氯化碳濃度大于4 mmol／L 時(shí)，對(duì)肝細(xì)胞具有顯著的抑制作用（P＜0.05）?；谝陨蠈?shí)驗(yàn)結(jié)果，用于構(gòu)建細(xì)胞損傷模型的藥物劑量分別為：APAP，6.5 mmol／L；大黃素，14 μmol／L；雷公藤甲素，18 nmol／L；馬兜鈴酸，35 μmol／L；四氯化碳，4 mmol／L。劑量選擇的依據(jù)是采用IC50 的一半劑量或者采用誘導(dǎo)細(xì)胞顯著損傷（P＜0.05）的劑量（四氯化碳）［22，23］。采用以上劑量構(gòu)建肝細(xì)胞損傷模型，對(duì)不同類型肝損傷模型進(jìn)行代謝組學(xué)分析。

圖1 質(zhì)控樣本的保留時(shí)間重復(fù)性和穩(wěn)定性分析結(jié)果Fig.1 Analytical results of retention time repeatability and stability obtained from quality control sample

2.3 藥物肝損傷的代謝組學(xué)分析

對(duì)各類型藥物肝損傷的代謝譜進(jìn)行PCA 分析，結(jié)果見圖3a，正常組、APAP 損傷組、四氯化碳損傷組和中藥活性成分損傷組（大黃素、雷公藤甲素和馬兜鈴酸）呈現(xiàn)明顯的聚類特征。高度集中的質(zhì)控樣本點(diǎn)表明該分析過程具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。以上結(jié)果表明，不同類型的肝損傷在代謝物水平上具有顯著的差異。

圖2 大黃素、雷公藤甲素、馬兜鈴酸、對(duì)乙酰氨基酚和四氯化碳對(duì)HL7702 細(xì)胞的48 h 抑制曲線Fig.2 Inhibition curves of emodin，triptolide，aristolochic acid （AA），acetaminophen （APAP）and CCl4 to HL7702 cells for 48 h

圖3 藥物干預(yù)后肝細(xì)胞代謝譜的PCA 和PLS-DA 分析結(jié)果Fig.3 PCA and PLS-DA models of hepatocytes metabolic profiling after drug treatment

2.4 肝損傷差異代謝物分析

根據(jù)PLS-DA 得到的變量權(quán)重值（VIP 值），篩選出VIP ＞1.5 的變量作為肝毒性差異變量（見圖4a）。對(duì)差異變量在各樣本中的相對(duì)含量進(jìn)行熱圖分析，結(jié)果見圖4b，可以看出與正常組相比，損傷組中變量的水平發(fā)生了顯著的變化。最終鑒定出14個(gè)潛在的肝毒性標(biāo)志物（見表1），包括植烷酸、13，14-二羥基-二十二烷酸、2-羥基-植烷酸、2-羥基-二十二烷酸、13-二十二烯酸、13-十八烯醇、3-羥基-二十四烷酸、4-羥基-6-二十二烷酮、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、谷胱甘肽（GSH）、鞘氨醇、苯基甘氨酸和小肽。其中，植烷酸、13，14-二羥基-二十二烷酸、2-羥基-植烷酸、2-羥基-二十二烷酸、13-十八烯醇、3-羥基-二十四烷酸和4-羥基-6-二十二烷酮均為脂類，與正常組相比，損傷組的含量都顯著性升高。脂類化合物的顯著變化表明藥物肝毒性擾亂了肝細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)鏈脂肪酸的正常代謝，尤其是脂肪酸的氧化過程。

圖4 （a）藥物肝損傷差異代謝物（VIP＞1.5）及（b）含量分布熱圖Fig.4 （a）Differential metabolites （VIP＞1.5）in drug injured hepatocytes and （b）their concentration distribution in heat map

已有研究顯示，很多肝臟毒物，如乙醇、丙酮等，可以干預(yù)細(xì)胞色素酶P450 的活性和脂肪酸的氧化過程。脂肪酸的羥基化過程與細(xì)胞色素酶CYP2E1的活性密切相關(guān)［24，25］。例如，亞型CYP4A 與脂肪酸的ω 羥基化有關(guān)［26］。綜上可以推測(cè)，本研究中脂肪酸代謝發(fā)生變化是由于藥物對(duì)細(xì)胞色素酶活性的影響所致。除此之外，肝細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的發(fā)生也是導(dǎo)致脂肪酸代謝紊亂的因素之一。NAD和GSH是維持肝細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡的兩種重要代謝物。NAD 廣泛存在于各種組織中，作為一種電子載體，參與多種酶促反應(yīng)，如脂肪酸氧化［27，28］。GSH 是一種細(xì)胞抗氧化劑，GSH 調(diào)節(jié)的藥物代謝往往是胞內(nèi)GSH 耗竭的主要原因［29］。GSH 耗竭會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化的發(fā)生。因此，藥物干預(yù)后肝細(xì)胞內(nèi)NAD 和GSH 耗竭，進(jìn)一步導(dǎo)致氧化應(yīng)激和脂肪酸代謝紊亂是藥物肝損傷的主要原因。

表1 藥物肝毒性差異代謝物的鑒定結(jié)果Table 1 List of discriminating metabolites induced by hepatotoxicants

2.5 聯(lián)苯雙酯對(duì)肝損傷差異標(biāo)志物的調(diào)控

圖5 聯(lián)苯雙酯干預(yù)后的（a）肝細(xì)胞活力變化和（b）PCA 分析結(jié)果Fig.5 （a）Liver cell viability changes and （b）PCA model results after bifendate treatment

為了驗(yàn)證肝損傷差異代謝物的可靠性，采用保肝陽性藥聯(lián)苯雙酯對(duì)雷公藤甲素?fù)p傷的肝細(xì)胞模型進(jìn)行治療。細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果顯示，聯(lián)苯雙酯對(duì)肝損傷的減弱作用具有劑量依賴性，劑量大于40 μmol／L 時(shí)，可以顯著減弱雷公藤甲素對(duì)肝細(xì)胞活性的抑制作用（見圖5a）。根據(jù)細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)，我們選擇聯(lián)苯雙酯有效劑量40 μmol／L 和雷公藤甲素共同干預(yù)肝細(xì)胞48 h，平行設(shè)置正常對(duì)照組和雷公藤甲素?fù)p傷組。收集細(xì)胞樣品按照上述方法進(jìn)行代謝組學(xué)分析。模式識(shí)別結(jié)果顯示，損傷組、共同干預(yù)組和對(duì)照組呈現(xiàn)較好的聚類效果（見圖5b），共同干預(yù)組有向正常組靠近的趨勢(shì)，由此推測(cè)聯(lián)苯雙酯對(duì)肝損傷具有一定的減弱作用，另一方面也驗(yàn)證了代謝組學(xué)用于藥物肝損傷標(biāo)志物研究的可行性。聯(lián)苯雙酯對(duì)已鑒定到的14 種潛在標(biāo)志物的調(diào)控作用見圖6。結(jié)果顯示，這些代謝物的水平都有一定程度的恢復(fù)，由此驗(yàn)證這些代謝物均與藥物肝毒性有著密切的關(guān)系。作為臨床上常用的肝損傷治療藥物，聯(lián)苯雙酯可在一定程度上治療肝損傷引起的機(jī)體代謝紊亂，常被用作研究新型保肝藥的陽性對(duì)照藥［30］。因此檢測(cè)聯(lián)苯雙酯干預(yù)肝細(xì)胞后標(biāo)志代謝物的變化，可在一定程度上驗(yàn)證肝毒性標(biāo)志物的可靠性。

圖6 肝毒性相關(guān)標(biāo)志物在正常組、雷公藤損傷組和聯(lián)苯雙酯共同作用組的相對(duì)含量變化Fig.6 Relative intensities of identified differential metabolites in control，triptolide-injured and bifendate-triptolide-treated groups

3 結(jié)論

本文采用基于UPLC-MS 的細(xì)胞代謝輪廓分析，檢測(cè)了不同類型藥物肝損傷的代謝譜特征，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析，篩選了與藥物肝毒性相關(guān)的代謝物，包括羥基化脂肪酸及衍生物、NAD、GSH 和小肽。代謝通路分析顯示藥物損傷后，肝細(xì)胞的脂肪酸代謝和氧化應(yīng)激發(fā)生了顯著變化，與現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道情況基本相符。通過保肝陽性藥聯(lián)苯雙酯對(duì)肝損傷模型的代謝譜調(diào)控研究，驗(yàn)證了肝毒性潛在標(biāo)志物的可靠性。本研究結(jié)果證明，通過細(xì)胞代謝物的差異表達(dá)來尋找與肝損傷相關(guān)的差異代謝物是一種簡(jiǎn)單有效的方法，可以與傳統(tǒng)的以動(dòng)物、臨床病人血液、尿液為樣本的代謝組學(xué)研究相互佐證與補(bǔ)充，以期為臨床肝損傷的診斷、治療提供準(zhǔn)確全面的信息。

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