王曉倩， 高 鐵， 洪 專， 屈 鋒*

（1. 北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京100081；2. 國(guó)家海洋局海洋生物資源綜合利用工程技術(shù)研究中心，福建 廈門361000）

貝類毒素是有毒有害赤潮生物產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)的總稱。軟骨藻酸（domoic acid，DA）是貝類毒素的一種，它溶于水且具有強(qiáng)烈的神經(jīng)毒性，是與紅藻酸（2-羧基-3-異丙烯基脯氨酸）相關(guān)的非蛋白氨基酸類活性物質(zhì)［1］。其分子結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 軟骨藻酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of domoic acid

水中的貝類和魚類對(duì)DA 有較強(qiáng)的耐受力，可以富集藻類產(chǎn)生的DA，再經(jīng)食物鏈進(jìn)行傳遞。人類食用被DA 污染的海產(chǎn)品后即可引起中毒。因此，DA 的毒理作用及檢測(cè)對(duì)于海洋生物學(xué)和海洋食品安全研究十分必要。目前DA 的研究多見于定量分析檢測(cè)，如酶聯(lián)免疫法［2］、膠體金免疫層析法［3］、高效液相色譜法［4，5］以及毛細(xì)管區(qū)帶電泳法［6-9］。DA 與谷氨酸受體作用使細(xì)胞內(nèi)Ca2＋蓄積超載并進(jìn)入線粒體，抑制氧化磷酸化，造成ATP 合成不足，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和壞死［10，11］。DA 可影響某些神經(jīng)損傷與修復(fù)相關(guān)基因的表達(dá)及蛋白質(zhì)的上調(diào)與下調(diào)，如增強(qiáng)WDR35 蛋白質(zhì)的表達(dá)，也可直接導(dǎo)致DNA 損傷［12-15］。上述毒理學(xué)研究大多采用動(dòng)物或細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)與DA 毒性作用相關(guān)的蛋白質(zhì)。由此可見，研究DA 與重要功能蛋白質(zhì)的相互作用有助于了解DA 對(duì)生物大分子的毒性機(jī)制分析。建立可與DA 作用的功能蛋白質(zhì)的快速篩選方法，有助于理解DA 的毒性機(jī)理，為DA 的解毒作用和DA毒性的防護(hù)提供基礎(chǔ)信息。

目前DA 與其他重要功能蛋白質(zhì)作用的研究鮮見報(bào)道。本文選擇血漿、腸道及細(xì)胞線粒體中9 種重要的功能蛋白質(zhì)，基于親和毛細(xì)管電泳，定性比較了這些蛋白質(zhì)與DA 的相互作用強(qiáng)弱。目的是將親和毛細(xì)管電泳用于DA 作用靶蛋白的快速篩選，拓展毛細(xì)管電泳在DA 受體蛋白篩選中的應(yīng)用，也為其他受體蛋白的篩選提供高效，快速，低成本的方法。目前關(guān)于DA 與上述功能蛋白質(zhì)作用評(píng)價(jià)的研究尚未見報(bào)道。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

Agilent 7100 毛細(xì)管電泳儀，配備二極管陣列（DAD）檢測(cè)器（美國(guó)Agilent 公司）。

軟骨藻酸（DA）由國(guó)家海洋局海洋生物資源綜合利用工程技術(shù)研究中心提供；人凝血酶（H-Thr）購(gòu)自Enzo Life Sciences 公司；細(xì)胞色素C（Cyt C）、胰蛋白酶（Try）、免疫球蛋白E （Ig E）、核糖核酸酶A（RNase A）、λ 核酸外切酶（λExo）、轉(zhuǎn)鐵蛋白（Trf）、鐵蛋白（Fer）、凝集素（Lec）均購(gòu)自Sigma公司；二甲基亞砜（DMSO，純度＞99.5%）購(gòu)自北京拜爾迪公司。

氫氧化鈉、硼砂和硼酸（分析純），購(gòu)自北京化工廠；實(shí)驗(yàn)室用水為蒸餾水。

熔融石英毛細(xì)管購(gòu)自邯鄲市鑫諾光纖色譜有限公司。

1.2 溶液的配制

將50 mmol／L Na2B4O7溶液和200 mmol／L H3BO3溶液以6 ∶4 的體積比混合，配制200 mmol／L（pH 8.7）硼酸鹽儲(chǔ)備液，并稀釋為50 mmol／L（pH 8.7）硼酸鹽溶液作為電泳緩沖液，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后使用。

精確稱量軟骨藻酸純品0.001 0 g，加水1 mL溶解，搖勻，作為儲(chǔ)備液，質(zhì)量濃度為1 mg／mL，-20℃保存。

1.3 毛細(xì)管電泳實(shí)驗(yàn)條件

熔融石英毛細(xì)管（有效長(zhǎng)度／總長(zhǎng)：40 cm／48.5 cm，內(nèi)徑75 μm）；進(jìn)樣壓力：5 kPa；進(jìn)樣時(shí)間：5 s；分離電壓：＋20 kV；分離溫度：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：214 nm（親和毛細(xì)管電泳），242 nm（毛細(xì)管區(qū)帶電泳）。

新毛細(xì)管在使用前分別用1 mol／L NaOH、0.1 mol／L NaOH、H2O 各沖洗30 min。兩次實(shí)驗(yàn)進(jìn)樣間用0.1 mol／L NaOH、H2O 和緩沖液各沖洗3 min。毛細(xì)管不用時(shí)兩端水封，于室溫下保存。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白質(zhì)的特性及生理功能

本文選用9 種重要的功能蛋白質(zhì)作為DA 作用的靶標(biāo)，其中人凝血酶、lgE、轉(zhuǎn)鐵蛋白、鐵蛋白和凝集素為血漿蛋白；核糖核酸酶A 和λ 核酸外切酶為核酸酶；還有位于腸道中的胰蛋白酶及與生物氧化相關(guān)的細(xì)胞色素C。

2.2 親和毛細(xì)管電泳分析法

親和毛細(xì)管電泳通?？捎糜谟H和配體和受體間結(jié)合常數(shù)的計(jì)算。將不同濃度的配體加入背景電泳溶液中，受體因與溶液中的配體發(fā)生親和作用導(dǎo)致受體的遷移時(shí)間隨配體濃度的增加而發(fā)生改變，即淌度遷移法。具體公式如下［16］：

ML：溶液中蛋白質(zhì)配體濃度為L(zhǎng) 時(shí)受體與電滲流的淌度比；μi：受體的有效淌度；μapp：表觀淌度；μeof：電滲流淌度；teof：電滲流遷移時(shí)間；ti：受體遷移時(shí)間；M0：溶液無蛋白質(zhì)配體時(shí)的淌度比；ΔM：淌度比的差值；ΔMmax：形成復(fù)合物達(dá)到飽和時(shí)淌度比的變化量；Kb：結(jié)合常數(shù)。以1／ΔM 與1／L 作線性圖，Kb為截距與斜率之比。

淌度遷移法一般可用于親和力較強(qiáng)時(shí)受體配體相互作用的結(jié)合常數(shù)計(jì)算。但實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)親和作用較弱時(shí)，結(jié)合常數(shù)為負(fù)值，故不能直接計(jì)算結(jié)合常數(shù)。因此，親和作用弱時(shí)，可通過淌度比的變化量ΔM 隨蛋白質(zhì)配體濃度L 的變化來定性比較親和作用［17］。當(dāng)配體濃度L 增加時(shí)，ΔM 的增量越大，則受體與配體的相互作用越強(qiáng)。以ΔM 與L 作線性圖，斜率越大，表明相互作用越強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)中，以中性二甲基亞砜（DMSO）為電滲流標(biāo)記物，將0、0.2、0.4、0.6、0.8 μmol／L 的9 種配體蛋白質(zhì)（H-Thr、Ig E、Try、Cyt C、RNase A、λExo、Trf、Fer、Lec）分別加入電泳緩沖液，檢測(cè)0.2 mg／mL DA 隨蛋白質(zhì)濃度增加的遷移時(shí)間改變。

2.3 DA 與蛋白質(zhì)作用的比較

2.3.1 與DA 作用的蛋白質(zhì)

圖2 和圖3 為親和毛細(xì)管電泳圖。圖2 電泳圖中DA 峰隨蛋白質(zhì)濃度增加，其遷移時(shí)間明顯延長(zhǎng)。由于蛋白質(zhì)濃度增大，同時(shí)導(dǎo)致溶液黏度增大，通過電滲流變化進(jìn)行校正，DA 相對(duì)DMSO 的遷移時(shí)間也增加。且6 種蛋白質(zhì)加入溶液時(shí)，DA 峰隨蛋白質(zhì)濃度增加變矮展寬（見圖2），表明DA 和6 種蛋白質(zhì)之間存在相互作用。其中，以圖2 H-Thr 譜圖中峰遷移最明顯，H-Thr 的濃度達(dá)0.6 μmol／L 時(shí)，30 min 已不能檢測(cè)到DA 的峰。相比之下，λExo的峰遷移最小，相互作用最弱。

圖2 DA 與6 種蛋白質(zhì)的親和毛細(xì)管電泳圖Fig.2 Affinity capillary electropherograms of domoic acid （DA）and six proteins

2.3.2 不與DA 作用的蛋白質(zhì)

Trf、Fer 和Lec 作為配體時(shí)，蛋白質(zhì)濃度增加并未引起DA 遷移時(shí)間的趨勢(shì)性增加，DA 也無明顯的峰展寬（見圖3），說明Trf、Fer 和Lec 與DA 無明顯相互作用。

圖3 DA 與3 種蛋白質(zhì)的親和毛細(xì)管電泳圖Fig.3 Affinity capillary electropherograms of domoic acid and three proteins

2.3.3 相互作用的定性比較

進(jìn)一步比較淌度比變化量ΔM 與9 種蛋白質(zhì)濃度L 的線性圖斜率，可知蛋白質(zhì)與DA 的相互作用強(qiáng)弱為：H-Thr ＞Cyt C ≈Try ≈Ig E ≈RNase A ＞λExo （見圖4a）。而Fer、Trf、Lec 未能表現(xiàn)出一定的親和力（見圖4b）。此處，親和電泳圖的直觀比較與淌度比變化量ΔM-蛋白質(zhì)濃度L 線性關(guān)系的斜率值判斷結(jié)果一致。

根據(jù)以上結(jié)果初步推斷，人體攝入DA 后，DA有可能與胰蛋白酶結(jié)合，減少DA 吸收入血。入血的DA 又可與凝血酶較強(qiáng)結(jié)合，從而影響正常的凝血功能。DA 還有可能在一定程度上減輕或抑制由血清Ig E 含量過高而引起I 型過敏反應(yīng)。此外，DA與核酸酶RNase A，λExo 也存在一定的親和作用，可能引起DNA 的損傷。細(xì)胞色素C 存在于線粒體中，DA 不易進(jìn)入線粒體，但DA 毒性可導(dǎo)致線粒體功能紊亂，誘發(fā)細(xì)胞色素C 釋放到細(xì)胞質(zhì)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［11］。因此，體內(nèi)DA 能否與細(xì)胞色素C 發(fā)生作用，作用后是否產(chǎn)生生理影響等尚不得而知，需要進(jìn)一步探討。

圖4 淌度比的變化量（ΔM）與蛋白質(zhì)配體濃度（L）的關(guān)系Fig.4 Relationships between variation of mobility ratio （ΔM）and protein ligand concentration （L）

目前尚未見到DA 的親和毛細(xì)管電泳研究報(bào)道。為了驗(yàn)證所建立的親和毛細(xì)管電泳方法可靠，在1.3 節(jié)所述實(shí)驗(yàn)條件下，進(jìn)行了DA 的毛細(xì)管區(qū)帶電泳分析，并將此實(shí)驗(yàn)結(jié)果與李大志等［8］采用BioFocus 3000 全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀的DA 檢測(cè)結(jié)果對(duì)比。由表1 可知，本文的DA 檢測(cè)結(jié)果與文獻(xiàn)［8］基本吻合，且DA 峰的遷移時(shí)間和峰面積的精密度和重現(xiàn)性更優(yōu)。因此，利用親和毛細(xì)管電泳法，根據(jù)DA 遷移時(shí)間變化來定性分析9 種蛋白質(zhì)與DA 的親和作用可行。

表1 軟骨藻酸的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、精密度及重現(xiàn)性Table 1 Linear ranges，regression equations，correlation coefficients （R2），limits of detection （LODs），precisions and repeatabilities of domoic acid

3 結(jié)論

基于親和毛細(xì)管電泳法，將蛋白質(zhì)作為配體加入電泳緩沖液，通過DA 在電泳圖中的淌度遷移可直觀判斷蛋白質(zhì)與DA 的相互作用強(qiáng)弱。通過DA淌度比與蛋白質(zhì)濃度線性關(guān)系可定性比較相互作用強(qiáng)弱。由于DA 具有強(qiáng)烈的神經(jīng)毒性，對(duì)于可與DA作用的多種蛋白質(zhì)的篩選，親和電泳毛細(xì)管無疑是一種高效、快速、所需DA 樣品量極低的篩選方法。方法具有一定的普適性。

［1］ Quilliam M A. J Chromatogr A，2003，1000（1／2）：527

［2］ Linskens H F，Jackson J F. Plant Toxin Analysis. Berlin：Springer-Verlag，1992：185

［3］ Gao L L，Cheng J P，Liu Y Y，et al. Environmental Science（高利利，程金平，劉元嫄，等. 環(huán)境科學(xué)），2011，32（8）：2492

［4］ Wang Q，Cheng J P，Gao L L，et al. Journal of Anhui Agricultural Science （王茜，程金平，高利利，等. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)），2011，39（26）：16070

［5］ Wu Y X，Lin F，Lin H D，et al. Chinese Journal of Analysis Laboratory （吳映璇，林峰，林海丹，等. 分析試驗(yàn)室），2008，27（Suppl）：173

［6］ Zhao J Y，Thibault P，Quilliam M A. Electrophoresis，1997，18：268

［7］ Kvasnicka F，Sevcik R，Voldrich M. J Chromatogr A，2006，1113（1／2）：255

［8］ Li D Z，Zhu W J，Song W B，et al. Chinese Journal of Chromatography （李大志，祝文君，宋文斌，等. 色譜），2002，20（2）：125

［9］ Wei F，Wang Z T. Chinese Journal of Food Hygiene （衛(wèi)鋒，王竹天. 中國(guó)食品衛(wèi)生雜志），2003，15（2）：107

［10］ Gao H，Chen X P. Foreign Medical Sciences：Section of Hygiene （高虹，陳西平. 國(guó)外醫(yī)學(xué)：衛(wèi)生學(xué)分冊(cè)），2002，29（5）：297

［11］ Wu D M，Zhang Y Q，Cheng W，et al. Asian Journal of Ecotoxicology （吳冬梅，張雁秋，程偉，等. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)），2013，8（1）：1

［12］ Lefebvre K A，Tilton S C，Bammler T K，et al. Toxicol Sci，2009，107（1）：65

［13］ Pérez-Gómez A，Tasker R A. BMC Neurosci，2013，14：72

［14］ Tsunekawa K，Kondo F，Okada T，et al. BMC Neurosci，2013，14：4

［15］ Carvalho Pinto-Silva C R，Moukha S，Matias W G，et al.Environ Toxicol，2008，23（6）：657

［16］ Liu X P，Du Y X. Eur J Med Chem，2010，45（9）：4043

［17］ Zhao X Y，Guo S Y，Chen F，et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry（趙新穎，郭淑元，陳凡，等. 分析化學(xué)），2013，41（8）：1204