徐國鑫 李效尊 劉蓬 尹靜靜 吳修
摘要:通過組織切片制片和染色方法改進(jìn),建立了能夠清晰顯示藕的組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的技術(shù)體系,并在此基礎(chǔ)上分析了淀粉粒、維管束和分泌細(xì)胞的分布規(guī)律。
關(guān)鍵詞:藕;組織切片;顯微結(jié)構(gòu)
中圖分類號:S645.101
文獻(xiàn)標(biāo)識號:A
文章編號:1001-4942(2015)10-0029-04
蓮是睡蓮科多年生水生草本植物,藕是其膨大的根狀莖,藕營養(yǎng)成分豐富,是我國優(yōu)良的特色蔬菜和副食佳品。藕的地方品種數(shù)量繁多,品質(zhì)各有特色。隨著我國人民生活水平的改善,消費(fèi)者對藕品質(zhì)的要求日益提高,其品質(zhì)性狀成為蓮藕育種和食品領(lǐng)域?qū)<谊P(guān)注的重點(diǎn)。
以往對于藕品質(zhì)的研究,主要從測定其所含糖類、淀粉、纖維素等成分入手,而針對其細(xì)胞形態(tài)和內(nèi)含物質(zhì)分布規(guī)律的研究比較缺乏。石蠟切片技術(shù)被廣泛應(yīng)用于植物組織結(jié)構(gòu)研究,但是對于不同特性的植物樣品,需要對制片和染色方法進(jìn)行改進(jìn)。目前尚未見藕石蠟切片制作技術(shù)相關(guān)研究的報(bào)道。
本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),蓮藕細(xì)胞內(nèi)含有大量淀粉粒,使用蕃紅、固綠和甲苯胺藍(lán)等傳統(tǒng)染色方法對藕的石蠟切片進(jìn)行染色,效果不夠理想。為此筆者經(jīng)過多次試驗(yàn)探索出PAS反應(yīng)-甲苯胺藍(lán)雙重染色的方法,它能清晰顯示出藕的細(xì)胞壁、維管束和淀粉粒等結(jié)構(gòu),從而可增進(jìn)對蓮藕組織結(jié)構(gòu)的了解,也為進(jìn)一步研究其發(fā)育過程和貯藏物質(zhì)積累規(guī)律提供必要技術(shù)手段。
1材料與方法
1.1試驗(yàn)材料
蓮藕雜交品系由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水生生物研究中心培育,種植于該院飲馬泉試驗(yàn)基地。2014年12月設(shè)三個取樣點(diǎn)挖取其膨大的地下莖,選其節(jié)段中部為供試材料。
1.2試驗(yàn)方法
1.2.1所需試劑 ①FAA固定液:50%乙醇:福爾馬林:冰醋酸=90:5:5。②席夫(Sehiff)試劑:稱取堿性品紅0.5g,加入蒸餾水100mL,沸水浴加熱溶解5min,冷卻至室溫后經(jīng)濾紙過濾,加入偏亞硫酸氫鈉1g和濃鹽酸2mL,充分混勻后避光密封保存,約24h后試劑變成淺黃色即可使用。③改良甲苯胺藍(lán)染色液:稱取甲苯胺藍(lán)0.5g,加入30%乙醇100mL,加熱至65℃,攪拌30min,過濾后避光保存。
1.2.2制片 石蠟切片方法參照田晨霞等的方法并進(jìn)行改進(jìn),具體步驟為:
①固定:將蓮藕莖段中部切成厚度2mm的薄片,浸入FAA固定液中,用真空泵抽氣20min,固定12h以上。
②脫水:依次通過質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%、75%、95%、100%梯度乙醇溶液,100%乙醇溶液需更換3次,每次2h。依次通過體積比為50%、75%、100%梯度乙醇/二甲苯溶液,100%二甲苯溶液需更換3次,每次2h。
③浸蠟:將樣品浸入50%石蠟/二甲苯溶液中,置于60℃烘箱,6h后將50%石蠟/二甲苯溶液吸出,換全蠟3次,每次6h。將樣品倒入包埋模具中,冷卻至室溫。
④切片:在轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)上切成厚度為10μm切片,置于載玻片上,40℃展片;載玻片上的水分徹底蒸發(fā)后,用二甲苯脫蠟、無水乙醇浸洗。
⑤復(fù)水:依次通過質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%、95%、75%、50%和30%梯度乙醇溶液。
1.2.3染色 以傳統(tǒng)的甲苯胺藍(lán)染色法作為對照,使用PAS-甲苯胺藍(lán)染色法對藕石蠟切片進(jìn)行染色,具體步驟如下:
①PAS染色:參考Bronner的方法,并進(jìn)行改進(jìn)。將粘附有切片的載玻片浸入0.4%(W/W)的高碘酸鉀溶液中處理20min,自來水沖洗,蒸餾水浸洗3次,每次2min;浸入Sehiff試劑中染色20min,自來水沖洗,蒸餾水浸洗2次,每次1min。
②甲苯胺藍(lán)染色:將載玻片浸入改良甲苯胺藍(lán)染色液中,染色10min,自來水沖洗,蒸餾水浸洗2次,每次1min,35℃烘干。中性樹膠封片,鏡檢拍照。
2結(jié)果與分析
2.1染色效果比較
在顯微鏡下觀察傳統(tǒng)甲苯胺藍(lán)染色法染色后的藕石蠟切片(圖1),可以看到,甲苯胺藍(lán)對不同成分的著色特異性較差,只能將淀粉粒和薄壁細(xì)胞染為淡藍(lán)色(圖1A),并且對表皮細(xì)胞著色過深(圖1B),無法看清細(xì)胞內(nèi)含物質(zhì)情況。
使用PAS-甲苯胺藍(lán)雙重染色法獲得的切片,細(xì)胞形態(tài)飽滿,細(xì)胞壁被染為藍(lán)色,細(xì)胞內(nèi)的淀粉粒被染為紫紅色,維管束、氣腔和分泌細(xì)胞等結(jié)構(gòu)清晰(圖2B)。本方法不但能夠區(qū)分不同組織和結(jié)構(gòu)的分布情況,而且染色效果穩(wěn)定,經(jīng)封片后可以保存數(shù)月而不褪色。
2.2藕組織結(jié)構(gòu)觀察
以最外層的細(xì)胞為第1層細(xì)胞,依次向內(nèi)統(tǒng)計(jì)細(xì)胞層數(shù)。藕的表皮共有2層細(xì)胞構(gòu)成,其細(xì)胞壁較厚,細(xì)胞內(nèi)不含淀粉粒;其中第1層細(xì)胞的內(nèi)含物較少,第2層細(xì)胞被黑褐色物質(zhì)充滿,可能是由酚類物質(zhì)在制片過程中受到氧化形成的(圖2B)。從第3層細(xì)胞開始呈現(xiàn)薄壁細(xì)胞形態(tài),細(xì)胞體積和內(nèi)部淀粉粒的體積逐層增大(圖3、圖4),至第6層細(xì)胞之后,細(xì)胞呈相間排列,分層不明顯。薄壁細(xì)胞之間散在分布有維管束,靠近表皮的維管束較細(xì)(圖2C);靠近內(nèi)側(cè)的維管束較粗,有2~3層維管束鞘細(xì)胞包圍,內(nèi)部含有氣腔(圖2D)。
此外,在薄壁細(xì)胞之間分布有少量的分泌細(xì)胞(圖2B、圖2D),分泌細(xì)胞內(nèi)部的物質(zhì)在切片制作過程中氧化成黑褐色的顆粒,推測這些物質(zhì)中含有較多的酚類,可能與藕食品加工過程中的褐化現(xiàn)象有關(guān)。
3討論與結(jié)論
本研究改進(jìn)組織切片染色方法后,能清晰顯示出藕的組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)。傳統(tǒng)的石蠟切片染色方法,使用蕃紅、固綠和蘇木精等染料,若染色條件控制不當(dāng)會導(dǎo)致染色不足和染色過度。本研究改為雙重染色法,首先使用PAS反應(yīng)將淀粉染成鮮紅色,再用甲苯胺藍(lán)將細(xì)胞壁染為藍(lán)色(淀粉粒也輕微著色而變成紫紅色),染色效果清晰穩(wěn)定(圖2)。
淀粉的含量和性質(zhì)與藕的品質(zhì)密切相關(guān)。本試驗(yàn)建立的組織制片技術(shù)體系能夠清晰地顯示淀粉粒的分布,對研究蓮藕淀粉的積累規(guī)律和評價蓮藕種質(zhì)資源均有重要意義。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)藕表皮細(xì)胞和分泌細(xì)胞中含有的物質(zhì)氧化后變?yōu)楹诤稚@些物質(zhì)可能與藕烹飪過程中的褐化現(xiàn)象有關(guān),需要進(jìn)一步探明褐化物質(zhì)的成分和積累規(guī)律。本研究成果為在細(xì)胞生物學(xué)水平上研究蓮藕品質(zhì)性狀奠定了基礎(chǔ),我們將結(jié)合其它技術(shù)手段解析影響蓮藕品質(zhì)的構(gòu)成因素,推動蓮藕品質(zhì)育種進(jìn)步。endprint