吳德龍　王志耕　梅林　薛秀恒

摘要：乳酸菌是促進(jìn)人體健康的一類典型益生菌，這類菌要達(dá)到其有益效果，活菌數(shù)至少應(yīng)達(dá)到100萬CFU/g。由于受到外界與人體胃環(huán)境的不良影響，裸露的菌體不易存活，將益生菌進(jìn)行微膠囊化被認(rèn)為是最為有效、最有前景的一種保護(hù)方法。本研究在單因素研究的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對真空低溫噴霧干燥制備微膠囊工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。試驗結(jié)果表明，在真空度為-0.05～-0.06 MPa條件下，最佳工藝條件為進(jìn)風(fēng)溫度79.07 ℃，進(jìn)料速度727.54 mL/h，菌壁比1 ∶ 4.55，保護(hù)載體（脫脂奶粉）量9.80%，此條件下的活菌數(shù)為2.81×108 CFU/g。

關(guān)鍵詞：乳酸菌；微膠囊；真空低溫；噴霧干燥法；響應(yīng)面；活菌數(shù)

中圖分類號： TS201.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0367-04

乳酸菌是對人體具有重要的生理和保健功能的益生菌，但乳酸菌不形成芽孢，故抗逆性差、易失活而不能很好地發(fā)揮其益生功能。 研究乳酸菌保護(hù)技術(shù)以降低其在食品加工儲藏、人體消化道等過程中的損失具有重要意義。目前，益生菌微膠囊化被認(rèn)為是最為有效、最有前景的一種方法。微膠囊制備方法有：噴霧成型法、乳化法、擠壓法、共凝聚/相分離法和靜電法等[1]，其中，噴霧成型法制備乳酸菌微膠囊具有干燥速率高、時間短、產(chǎn)品的分散性和溶解性好、生產(chǎn)過程簡單、適用于連續(xù)化生產(chǎn)等優(yōu)勢，成為工業(yè)化應(yīng)用技術(shù)研究的重點。本試驗重點研究真空低溫噴霧干燥制備乳酸菌微膠囊技術(shù)，優(yōu)化其工藝參數(shù)，為乳酸菌微膠囊生產(chǎn)提供一種低能耗、高活性產(chǎn)品的技術(shù)方案。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗜熱鏈球菌、乳酸桿菌保存于安徽省農(nóng)產(chǎn)品加工工程試驗室畜產(chǎn)品加工研究平臺；MRS培養(yǎng)基：杭州微生物試劑有限公司，NaCl：西隴化工股份有限公司；光明脫脂奶粉：光明乳業(yè)股份有限公司；麥芽糊精：山東西王糖業(yè)有限公司；阿拉伯樹膠粉：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；YC-2000實驗室低溫噴霧干燥機(jī)：上海雅程儀器設(shè)備有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SW-CJ-2D雙人單面超凈工作臺100級：蘇州凈化設(shè)備有限公司；日本日立SEMXL-20型掃描電子顯微鏡。

1.2 試驗方法

1.2.1 生長曲線的測定 以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)、測定的D600 nm值為縱坐標(biāo)，繪制2種菌的生長曲線。

1.2.2 菌懸液的制備 將保存的乳酸菌菌種在MRS固體培養(yǎng)基中活化2次后，接種于新鮮的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至對數(shù)期末、穩(wěn)定期前。收集穩(wěn)定期前期的菌液，3 500 r/min離心10min。去上清，將收集到的菌體用無菌生理鹽水洗滌，再次離心，重復(fù)3次。用20mL無菌生理鹽水重新懸浮菌體，備用。

1.2.3 工藝流程 將阿拉伯樹膠粉與麥芽糊精按1 ∶ 8[2-3]溶于相應(yīng)量的去離子水，固形物含量為15%→40 ℃加熱，4 000 r/min高速分散10 min，攪拌至完全溶解→靜置待泡沫消去，加入含2種菌（1 ∶ 1）的20 mL菌懸液，40 ℃加熱，500 r/min攪拌5 min→加入相應(yīng)量的脫脂奶粉攪拌均勻→設(shè)置進(jìn)料速度與進(jìn)風(fēng)溫度，噴霧干燥。

1.2.4 單因素試驗 考察菌壁比、進(jìn)風(fēng)溫度、進(jìn)料速度、保護(hù)載體量對活菌數(shù)的影響。

1.2.4.1 菌壁比對活菌數(shù)的影響 在進(jìn)風(fēng)溫度80 ℃、進(jìn)料速度600 mL/h、保護(hù)載體量12.5%，菌壁比（體積比）分別為1 ∶ 2、1 ∶ 4、1 ∶ 6、1 ∶ 8、1 ∶ 10條件下進(jìn)行5組試驗，每組重復(fù)3次。

1.2.4.2 進(jìn)風(fēng)溫度對活菌數(shù)的影響 在進(jìn)料速度600 mL/h、菌壁比（體積比）1 ∶ 6、保護(hù)載體量12.5%，進(jìn)風(fēng)溫度分別為60、70、80、90、100 ℃進(jìn)行5組試驗，每組重復(fù)3次。

1.2.4.3 進(jìn)料速度對活菌數(shù)的影響 在進(jìn)風(fēng)溫度80 ℃、菌壁比（體積比）1 ∶ 6、保護(hù)載體量12.5%，進(jìn)料速度分別為200、400、600、800、1 000 mL/h進(jìn)行5組試驗，每組重復(fù)3次。

1.2.4.4 保護(hù)載體量對活菌數(shù)的影響 在進(jìn)風(fēng)溫度80 ℃、進(jìn)料速度600 mL/h、菌壁比（體積比）1 ∶ 6，保護(hù)載體量分別為7.5%、10.0%、12.5%、15.0%、17.5%條件下進(jìn)行5組試驗，每組重復(fù)3次。

1.2.5 活菌數(shù)測定 取噴霧干燥得到的粉末0.5 g溶于50 mL滅菌生理鹽水中→37 ℃、180 r/min振蕩1 h至粉末完全溶解→按GB 4789.35—2010《食品微生物學(xué)檢驗 乳酸菌檢驗》，梯度稀釋涂平板，得活菌數(shù)。

1.2.6 電鏡掃描 對經(jīng)冷凍干燥預(yù)處理的裸菌和噴霧干燥粉末電鏡掃描，觀察微觀結(jié)構(gòu)。

1.2.7 響應(yīng)面分析 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗設(shè)計原理，以進(jìn)風(fēng)溫度、進(jìn)料速度、菌壁比、保護(hù)載體量為自變量，活菌數(shù)的對數(shù)值為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面法分析優(yōu)化真空低溫噴霧干燥制備乳酸菌微膠囊工藝參數(shù)。響應(yīng)面因素和水平設(shè)計見表1。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 將試驗結(jié)果利用Excel、Design-Expert 8.0進(jìn)行直觀分析和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長曲線

從圖1可以看出，嗜熱鏈球菌在16 h后基本完成對數(shù)期，故選擇培養(yǎng)時間為16 h；同理乳酸桿菌選擇培養(yǎng)18 h（圖2）。

2.2 單因素試驗

2.2.1 菌壁比對活菌數(shù)的影響 從圖3可以看出，芯材與壁材在一個合適的比例得到的活菌數(shù)最高。菌壁比過高，芯材不能完全被包覆，包埋率下降，裸露的菌體在高溫下失活，活菌數(shù)降低。菌壁比過低，一方面降低單位體積的菌濃度，另一方面降低壁材利用率。本研究選擇菌壁比1 ∶ 4左右較為合適。endprint

2.2.2 進(jìn)風(fēng)溫度對活菌數(shù)的影響 在噴霧干燥工藝中進(jìn)風(fēng)溫度是主要考慮的因素之一[4-6]，從圖4可以看出，隨著進(jìn)風(fēng)溫度的升高，活菌數(shù)總體呈下降趨勢，60～80 ℃下降緩慢，80 ℃以后急劇下降。60～70 ℃時噴出的粉末含水率接近5%，不利于后期貯藏；而當(dāng)溫度升高至80 ℃時粉末的含水量降為3.9%，符合GB/T 5410—2008《乳粉（奶粉）》。溫度超過80 ℃使活菌數(shù)急劇下降，因此選擇進(jìn)風(fēng)最佳溫度80 ℃左右。

2.2.3 進(jìn)料速度對活菌數(shù)的影響 在噴霧干燥過程中，進(jìn)料速度越快，即單位時間內(nèi)要被霧化器霧化為小液滴的物料就越多，將料液干燥轉(zhuǎn)化為粉粒時所需的熱量就越多。因此，在其他因素一定的條件下，即單位時間內(nèi)，熱風(fēng)提供給物料的熱量一定時，進(jìn)料速度越大，干燥效果就越差[7]。另一方面本研究的芯材為生物活性物質(zhì)，干燥時間越長，失活程度越大。從圖5可以看出，進(jìn)料速度為200～600 mL/h時，物料與熱風(fēng)接觸時間過長，隨著進(jìn)料速度加快，活菌數(shù)上升。進(jìn)料速度為600～1 000 mL/h，進(jìn)料速度過快，隨著進(jìn)料速度的加快，干燥效果變差，活菌數(shù)下降。故選擇進(jìn)料速度為600 mL/h。

2.2.4 載體量對活菌數(shù)的影響 添加載體可帶走一部分水分蒸發(fā)的熱，減少熱對內(nèi)部微生物的傷害，相關(guān)研究表明，脫脂奶粉在與其他載體相比較時，具有優(yōu)越性[5]。從圖6可以看出，脫脂奶粉含量7.5%～10.0%時，隨著脫脂奶粉含量的增加，溶液黏度有規(guī)律遞增，體系穩(wěn)定，且水分蒸發(fā)時可帶走體系一部分熱量，使活菌數(shù)上升。脫脂奶粉含量10.0%～17.5%時，隨著脫脂奶粉含量的增加，溶液固形物含量偏高，出現(xiàn)粘壁現(xiàn)象，活菌數(shù)下降。故選擇載體量10.0%為最佳。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果分析

2.3.1 顯著性分析 Box-Benhnken試驗設(shè)計及結(jié)果見表2，各因素經(jīng)回歸擬合，得出二次回歸方程：

Y=-8.45+0.007 5A+0.019B+0.022C+0.005D+0002 5AB+0.017AC-0.007 5AD-0.01BC-0.015BD-0037CD-0.038A2-0.036B2-0.022C2-0.12D2。

從表3可以看出，模型的P值0.05，不顯著，該資料適用于二次項擬合。該模型的R2為93.53%，修正后87.06%，說明該模型能解釋8706%的響應(yīng)值變化，該模型與實際的擬合性較好。

從表3方差分析可以看出，菌壁比、載體量對活菌數(shù)的影響不顯著，進(jìn)風(fēng)溫度對活菌數(shù)的影響顯著，進(jìn)料速度對活菌數(shù)的影響極顯著，表明進(jìn)風(fēng)溫度與進(jìn)料速度對活菌數(shù)的影響呈較明顯的線性關(guān)系；進(jìn)料速度與載體量之間交互作用極顯著，其他各因素之間的交互作用均不顯著，說明進(jìn)料速度與載體量相互影響，不是簡單的主效應(yīng)疊加；進(jìn)料速度的二次項對活菌數(shù)的影響顯著，菌壁比、進(jìn)風(fēng)溫度、載體量的二次項對活菌數(shù)的影響極顯著，說明該模型中的二次項與活菌數(shù)并不是簡單的線性關(guān)系而是拋物線關(guān)系，這點可以從單因素看出。

剔除對回歸方程不顯著的、貢獻(xiàn)率不大的因素，得到二次回歸方程如下：

Y=8.45+0.019B+0.022C-0.037CD-0.038A2-0.036B2-0.022C2-0.12D2。

得到最佳工藝條件為菌壁比1 ∶ 4.76、進(jìn)風(fēng)溫度 79.52 ℃、進(jìn)料速度714.47 mL/h、載體量9.82%。在此工藝參數(shù)條件下，產(chǎn)品活菌數(shù)2.88×108 CFU/g。

從表3可以看出，各單因素對活菌數(shù)的影響大小排序為進(jìn)料速度>進(jìn)風(fēng)溫度>菌壁比>載體量。

2.3.2 響應(yīng)面立體圖分析 由回歸方程得出擬合的進(jìn)料速度與載體量對活菌數(shù)的影響的響應(yīng)面見圖7。表示當(dāng)進(jìn)風(fēng)溫度和菌壁比為零水平時，進(jìn)料速度和載體量對活菌數(shù)的影響。響應(yīng)曲面的坡度陡峭程度反映了因素對響應(yīng)值的影響力大小，表明因素間交互作用的強(qiáng)弱。從圖7可以看出，進(jìn)料速度與載體量之間的交互作用顯著。 圖8為等高線圖，等高線的形狀反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，越趨向橢圓表明交互作用越強(qiáng)，越趨向圓形則相反，表明交互作用越弱[8]。從圖8可以看出二者交互作用強(qiáng)。

2.4 電鏡掃描圖片與菌粉圖

電鏡條件為加速電壓3 kV，工作距離8.2 mm。3 000倍

電鏡掃描的圖片見圖9，左圖是微膠囊處理前，右圖是微膠囊處理后。8 000倍電鏡掃描圖片見圖10，左圖是微膠囊處理前，右圖是微膠囊處理后。對比可知乳酸菌包被效果良好，微膠囊的微觀結(jié)構(gòu)呈凹面空腔，表現(xiàn)為“扁球效應(yīng)”[9-10]。

噴霧干燥后的粉末樣見圖11，樣品呈淡黃色，質(zhì)感細(xì)膩，有淡淡乳香。

2.5 最佳工藝條件的預(yù)測和驗證

根據(jù)試驗所得模型預(yù)測出理論條件下低溫真空噴霧干燥制備微膠囊的最佳工藝條件為：菌壁比1 ∶ 4.55，進(jìn)風(fēng)溫度

79.07 ℃，進(jìn)料速度727.54 mL/h，載體量9.80%，活菌數(shù)288×108 CFU/g。按最佳組合工藝參數(shù)重復(fù)試驗3次，得實際活菌數(shù)2.81×108 CFU/g，與預(yù)測值的相對偏差小于3%。因此，基于響應(yīng)面法得到的優(yōu)化工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，有實用價值。

3 結(jié)論

研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面試驗設(shè)計對低溫噴霧干燥制備乳酸菌微膠囊的工藝進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化結(jié)果表明，菌壁比、進(jìn)風(fēng)溫度、進(jìn)料速度、載體量4個因素對噴霧干燥制備乳酸菌微膠囊的影響大小依次為：進(jìn)料速度>進(jìn)風(fēng)溫度>菌壁比>載體量，最佳工藝條件為菌壁比1 ∶ 4.55，進(jìn)風(fēng)溫度79.07 ℃，進(jìn)料速度727.54 mL/h，載體量9.80%，此條件下得到的微膠囊活菌數(shù)為2.81×108 CFU/g，滿足一般產(chǎn)品加工要求。

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