陳鐵柱，林 丹，汪 瑤，文飛燕，張驛帆，張 浩*

(1．四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川成都610041;2．四川大學(xué)華西藥學(xué)院，四川成都610041)

重樓是西部藥用植物中占據(jù)產(chǎn)業(yè)化利用主導(dǎo)地位、最具代表性和全局影響力的藥用植物資源之一。但其植物資源嚴(yán)重枯竭，目前已有一定數(shù)量的公司和個人開始了試驗性研究，進(jìn)行大規(guī)模的引種栽培。但栽培現(xiàn)狀比較混亂，主要體現(xiàn)在繁殖方式上，即野外采挖直接種植、根莖切割繁殖［1］、全根莖切割［2］、種子繁殖［3－5］，以上 4 種繁殖方式均不能打破重樓的生物學(xué)特性(生長緩慢、生長周期長、繁育系數(shù)低)，其目前的繁殖方式已經(jīng)嚴(yán)重制約了其資源再生和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。然而，經(jīng)長期野外調(diào)研和產(chǎn)地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在極其特定的環(huán)境下，重樓根莖會自然分根，即一個根莖上分根3～15株不等子根莖。子根莖移栽后，表現(xiàn)了明顯的速生性，3～4年后即可作商品藥材。此種分枝繁殖的方式提高了重樓3～15倍的繁殖系數(shù)，縮短了重樓6～7年的生育周期，產(chǎn)業(yè)化栽培前景非常好。筆者擬對能分枝繁殖出子根莖的重樓的環(huán)境因子和內(nèi)在因子進(jìn)行研究，明確分枝繁殖重樓的具體環(huán)境生態(tài)條件，通過有效成分含量測定分析，明確是否有藥用價值，以期為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)保障，為實現(xiàn)重樓資源再生策略和行動方向提供有效的借鑒手段和方法。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 藥材來源。在查詢標(biāo)本的情況下設(shè)定的走訪調(diào)查后，采到的具有子根莖的重樓藥材產(chǎn)地為四川省彭州市白鹿鎮(zhèn)、四川省崇州市街子古鎮(zhèn)和雞冠山鎮(zhèn)(表1)，由四川大學(xué)華西藥學(xué)院生藥學(xué)教研室張浩教授進(jìn)行原植物鑒定。留樣憑證標(biāo)本存放于生藥學(xué)標(biāo)本室，所有樣品均有原植物數(shù)碼照片。

表1 子根莖重樓樣品來源

1．1．2 儀器。LG－10A日本島津高效液相色譜儀;島津LabSolution色譜工作站;D1810D自動純水蒸餾器。

1．1．3 試劑。重樓皂苷I、II對照品購自中國藥品生物制品檢定所，其余6個皂苷對照品均為華西藥學(xué)院生藥201－203#實驗室人員分離得到(圖1)，分別為化合物1(重樓皂苷Ⅶ)、化合物2、化合物3(重樓皂苷H)、化合物4(重樓皂苷Ⅵ)、化合物5(重樓皂苷Ⅱ)、化合物6(纖細(xì)薯蕷苷)、化合物7(重樓皂苷Ⅰ)、化合物8(重樓皂苷Ⅴ)。乙腈為色譜純;甲醇為色譜純;水為雙蒸水。

圖1 重樓皂苷對照品1～8分子結(jié)構(gòu)

1．2 方法

1．2．1 資源調(diào)查方法。

1．2．1．1 文獻(xiàn)檢索查證，確定調(diào)查區(qū)域。通過查閱中國數(shù)字植物標(biāo)本館及四川省中醫(yī)藥科學(xué)院標(biāo)本館重樓標(biāo)本，以及走訪成都荷花池藥材市場的市場信息人員，明確了四川省重樓主要分布區(qū)域，確定了四川省洪雅市、峨眉山市、屏山縣、天全縣、蘆山縣、寶興縣、崇州市、邛崍市、彭州市、大邑縣、什邡市、安縣、巴中市為主要調(diào)查區(qū)域。

1．2．1．2 走訪調(diào)查。走訪調(diào)查當(dāng)?shù)厮庌r(nóng)、藥材收購點、藥材公司、飲片加工企業(yè)、農(nóng)業(yè)局、科技局、藥監(jiān)局等相關(guān)工作人員，了解野生重樓資源的分布情況。并走訪當(dāng)?shù)貧庀蟛块T，查閱氣候資料，了解當(dāng)?shù)貧夂蜃兓闆r。

1．2．2 品質(zhì)測定方法。

1．2．2．1 色譜條件的確立。含量測定前系統(tǒng)適應(yīng)性各項考察均參照《中國藥典》一部(2010年版)重樓藥材項下的含量測定相關(guān)操作［6］以及劉顯波的方法［7］進(jìn)行。色譜條件為色譜柱Kromasil C18柱(250×4．6 mm，5 μm)，Dikma C18保護(hù)柱(12．5 ×4．6 mm，5 μm);流動相為A(乙腈)∶B(水)二元梯度洗脫，梯度洗脫程序如表2所示;流速1．0 ml/min;柱溫35℃。氮氣流速為3．0 ml/min。檢測器漂移管溫度設(shè)置為102℃。進(jìn)樣體積為20 μl。

表2 梯度洗脫條件

1．2．2．2 對照品溶液制備。精密稱取各種皂苷對照品，用色譜甲醇定容于2 ml容量瓶中，制備混合對照品溶液，備用。1 ～8 號對照品濃度分別為 1．57、1．75、2．70、0．92、1．46、1．80、0．80、1．22 mg/ml，其色譜圖如圖 2 所示。

1．2．2．3 供試品溶液的制備。重樓樣品低溫干燥后打粉過篩(40目)。精確稱量粉末約0．50 g，加入50 ml甲醇，浸泡4 h后超聲提取30 min，過濾。重復(fù)上述操作1次，合并濾液，回收至干。加入色譜甲醇溶解并定容至10 ml，經(jīng)0．45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1．2．2．4 線性關(guān)系考察。精密吸取“1．2．2．2”混合重樓皂苷對照品溶液4、6、10、12、16、20 μl注入高效液相色譜儀，測定其峰面積值，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行回歸分析得回歸方程，其線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍如表3所示。

圖2 1～8號對照品溶液色譜圖

表3 對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)

1．2．2．5 精密度試驗。精密吸取“1．2．2．2”混合重樓皂苷對照品溶液，分別在“1．2．2．1”色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣 6 次，每次進(jìn)樣20 μl，分別測定峰面積，計算皂苷1～8號對照品的RSD 分別為 1．65%、1．01%、1．25%、2．01%、0．94%、1．83%、1．21%、1．78%，均小于3%，表明進(jìn)樣精密度良好。

1．2．2．6 重復(fù)性試驗。精密稱取同一批樣品(HCS1)6份，均按《中國藥典》2010版本重樓項下含量測定方法相關(guān)操作［6］制備供試品溶液，在“1．2．2．1”色譜條件下測定 8 種重樓皂苷的峰面積，計算皂苷1～8號的RSD分別為1．32%、1．04%、1．75%、1．43%、1．21%、1．63%、2．14%、2．35%，表明方法的重復(fù)性較好。

1．2．2．7 穩(wěn)定性試驗。取同一批樣品(HCS1)溶液，間隔0、4、8、24、48 h，進(jìn)樣5 次，每次 20 μl，按照“1．2．2．1”色譜條件進(jìn)行測定。計算皂苷1～8號的RSD分別為0．74%、0．45%、0．78%、0．83%、0．64%、1．17%、0．95%、1．25%，表明供試品溶液穩(wěn)定性良好。

1．2．2．8 加樣回收試驗。精密稱取6份已測知含量的同一批華重樓藥材(HCS1)，精密加入皂苷1、3、5、7號的對照品溶液適量，按《中國藥典》2010版重樓項下含量測定方法相關(guān)操作［6］制備供試品溶液，在“1．2．2．1”色譜條件下測定 4種重樓皂苷的峰面積，計算皂苷1、3、5、7號對照品的加樣回收率分別為 97．41%、96．84%、97．73%、98．81%;RSD 分別為1．83%、2．04%、1．45%、1．79%。

1．2．2．9 樣品測定。精密稱取不同重樓藥材粉末約0．50 g。按“1．2．2．3”方法制備供試品溶液，按“1．2．2．1”色譜條件進(jìn)樣20 μl，測得1～8號供試品色譜峰的峰面積，算出各樣品皂苷含量。

2 結(jié)果與分析

2．1 子根莖重樓的資源調(diào)查產(chǎn)地條件分析

2．1．1 分布條件。調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，具有子根莖的重樓主要集中分布在四川省的彭州市和崇州市，子根莖重樓資源分布范圍較廣，北至彭州市的白鹿鎮(zhèn)、南至崇州的雞冠山鎮(zhèn)，103°22'48″～103°54'57″E、30°37'48″～31°12'43″N 區(qū)域內(nèi)低山至高山均有分布，集中分布在海拔533～1 220 m的區(qū)域，土壤以弱酸性山地黃棕壤為主，土質(zhì)疏松肥沃(表4)。

表4 子根莖重樓資源的小生態(tài)環(huán)境

2．1．2 氣候條件。子根莖重樓主要分布在亞熱帶季風(fēng)帶氣候區(qū)(表5)。夏季較涼爽、冬季不嚴(yán)寒，年均溫度變化比較平緩，較少出現(xiàn)極冷極熱現(xiàn)象，年降水量比較充足(960～1 012 mm)，相對濕度較大(70% ～82%)，年平均溫度15．7～15．9 ℃，最冷月平均氣溫5．4 ～7．5 ℃，最熱月平均氣溫25．0～26．2℃，年均日照時數(shù)為1 161～1 180 h，無霜期278～285 d，以上條件為子根莖重樓適宜的生長條件。

表5 子根莖重樓分布區(qū)的氣象數(shù)據(jù)

2．1．3 土壤條件。土壤類型主要是山地黃棕壤，pH變化范圍為5．23～5．68(表4)，弱酸性。黃棕壤是最有利于重樓子根莖的生成，此種類型的土壤土層較厚、有機(jī)質(zhì)含量高，其垂直結(jié)構(gòu)為0～6 cm為枯枝落葉層、6～18 cm為腐殖層、18～39 cm為過渡層、39～100 cm為淀積層，為重樓的生長提供了足夠的營養(yǎng)，促進(jìn)形成子根莖。

2．2 子根莖重樓中皂苷含量分析

2．2．1 不同產(chǎn)地子根莖華重樓中皂苷含量。彭州10組具有子根莖的華重樓(HCS1)化學(xué)物1～化合物8均有檢出，重樓皂苷(Ⅰ+Ⅱ+Ⅵ+Ⅶ)的總量均達(dá)0．980 9%(表6)，達(dá)到《中國藥典》2010版重樓項下規(guī)定的最低0．60%的限量標(biāo)準(zhǔn)。同時，對從彭州8組具有子根莖的華重樓摘下子根莖(HCB2)進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)HCB2重樓皂苷(Ⅰ+Ⅱ+Ⅵ+Ⅶ)的含量不足HCB1的50%。對4批次崇州街子古鎮(zhèn)具有子根莖的華重樓(HCJ1～HCJ4)進(jìn)行檢測，每次均檢測出重樓皂苷Ⅶ、化合物2和重樓皂苷H，2014年10月采收的華重樓(HCJ2)重樓皂苷(Ⅰ+Ⅱ+Ⅵ+Ⅶ)含量為1．123 0%，是崇州街子古鎮(zhèn)4批次檢測樣品中唯一符合《中國藥典》重樓項下0．6%的限量標(biāo)準(zhǔn)的樣品。崇州市雞冠山鎮(zhèn)具有子根莖的華重樓重樓皂苷(Ⅰ+Ⅱ+Ⅵ+Ⅶ)含量為0．094 2%，為檢測的8個批次子根莖華重樓中含量最低的。崇州市雞冠山鎮(zhèn)具有子根莖的華重樓為一根雙株，皂苷含量低可能是雙株消耗了過多的營養(yǎng)，導(dǎo)致生成的重樓皂苷含量低。

2．2．2 同一產(chǎn)地具有子根莖的不同品種重樓皂苷含量。經(jīng)實地調(diào)查(表6)，崇州雞冠山鎮(zhèn)這一特定產(chǎn)地，發(fā)現(xiàn)5個重樓品種中某一單株均有子根莖現(xiàn)象，且子根莖發(fā)育成雙株或多株重樓。除了對具有子根莖的華重樓測定外，對具有子根莖且多株的卷瓣重樓、狹葉重樓、五指蓮、黑籽重樓皂苷含量也進(jìn)行了測定。測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有雙株子根莖黑籽重樓皂苷(Ⅰ+Ⅱ+Ⅵ+Ⅶ)含量達(dá)到了《中國藥典》重樓項下0．6%的限量標(biāo)準(zhǔn)，其他品種均未合格。對具有子根莖黑籽重樓主根中摘除的小根莖進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)重樓皂苷(Ⅰ+Ⅱ+Ⅵ+Ⅶ)含量不足主根莖的50%，與子根莖華重樓測定結(jié)果趨勢一致。

表6 重樓樣品中8種皂苷的含量%

3 結(jié)論與討論

(1)對有多芽分根繁殖的重樓區(qū)域進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)根莖重樓適宜的生長條件為在 103°22'48″～ 103°54'57″E、30°37'48″～31°12'43″N 533 ～1 200 m 的區(qū)域，土壤以弱酸性山地黃棕壤為主，年平均溫度15．7～15．9℃，最冷月平均氣溫5．4～7．5 ℃，最熱月平均氣溫25．0 ～26．2 ℃，年均日照時數(shù)為1 161～1 180 h，無霜期278～285 d。

(2)對不同產(chǎn)地華重樓皂苷含量進(jìn)行了測定，在8個批次樣品中，只有2個批次樣品重樓皂苷(Ⅰ+Ⅱ+Ⅵ+Ⅶ)含量達(dá)到《中國藥典》重樓項下0．6%的限量標(biāo)準(zhǔn)，對小根莖皂苷含量進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)其皂苷含量不足主根莖的50%，可能是由于用來檢測的子根莖生長僅為1年左右，有效成分還在積累階段，所以皂苷含量明顯很少。同一產(chǎn)地不同品種重樓含量測定發(fā)現(xiàn)，只有雙株子根莖黑籽重樓皂苷(Ⅰ+Ⅱ+Ⅵ+Ⅶ)達(dá)到了《中國藥典》重樓項下0．6%的限量標(biāo)準(zhǔn)，卷瓣重樓、狹葉重樓、五指蓮重樓均未合格。

(3)對黑籽重樓中摘除的小根莖進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)重樓皂苷(Ⅰ+Ⅱ+Ⅵ+Ⅶ)含量不足主根莖的50%，與子根莖華重樓測定結(jié)果趨勢一致。

(4)子根莖重樓皂苷含量部分可以達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)，且隨著重樓年限的生長，含量可能會逐漸增長，會有確切的療效，可以作為一個新的研究方向研究，能有效提高重樓的繁殖系數(shù)、縮短生育周期。

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