許 旭，耿丹丹，遲曉峰，董 琦，胡風(fēng)祖,*，肖遠燦,*

（1.中國科學(xué)院西北高原生物研究所，青海 西寧 810008；2.中國科學(xué)院大學(xué)生命科學(xué)院，北京 100049）

高效液相色譜光化學(xué)在線衍生熒光法檢測雞肉中16 種磺胺類藥物殘留

許 旭1,2，耿丹丹1,2，遲曉峰1，董 琦1，胡風(fēng)祖1,*，肖遠燦1,*

（1.中國科學(xué)院西北高原生物研究所，青海 西寧 810008；2.中國科學(xué)院大學(xué)生命科學(xué)院，北京 100049）

采用高效液相色譜-光化學(xué)柱后在線衍生-熒光檢測法檢測雞肉中16 種磺胺類藥物殘留量。雞肉樣品經(jīng)過乙腈提取并脫脂凈化，色譜柱分離，光化學(xué)在線衍生并直接用熒光檢測器檢測。流動相為0.3%的冰乙酸和甲醇溶液梯度洗脫，流速0.7 mL/min、柱溫36 ℃，激發(fā)波長320 nm、發(fā)射波長450 nm，16 種磺胺類藥物得到良好分離。16 種磺胺藥物在0.13～67.89 μg/mL質(zhì)量度范圍內(nèi)，線性良好（R≥0.994 0），回收率在61.2%～106.6%之間，相對標準偏差為0.3%～13.9%，檢出限為1.0～67.4 μg/kg。該方法靈敏、準確、快速，可滿足雞肉中磺胺類殘留的檢測。

雞肉；磺胺類藥物；光化學(xué)在線衍生；高效液相色譜-熒光檢測

磺胺類藥物是具有對氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類人工抗菌藥的總稱[1]，因其在動物養(yǎng)殖以及人類細菌性疾病的預(yù)防和治療中廣泛應(yīng)用[2-3]，可能導(dǎo)致磺胺類藥物會在人體累積，對人體健康形成潛在危險[4-6]。美國、歐盟等大多數(shù)國家規(guī)定動物源性食品中磺胺類藥物的最大殘留量為100 μg/kg[7-8]，我國規(guī)定動物源性食品中磺胺類藥物的最大殘留量為50～100 μg/kg[9]。

磺胺類藥物的檢測方法主要有微生物法[10-11]、分光光度法[11-12]、分子印記分析法[12]、免疫分析法[13]、毛細管電泳法[14-15]、高效液相色譜法[16-18]及其聯(lián)用技術(shù)[19-21]等?；前奉愃幬锉旧聿话l(fā)熒光，但其含有光化學(xué)活性基團，能發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生熒光物質(zhì)，從而可用熒光檢測器直接檢測[22]。光化學(xué)在線衍生不需要額外的衍生試劑，同時彌補了紫外法靈敏度低及質(zhì)譜法儀器昂貴的不足，更加綠色、環(huán)保、快捷、靈敏。目前，關(guān)于高效液相色譜-光化學(xué)在線衍生-熒光檢測法在檢測雞肉中磺胺類殘留的應(yīng)用尚未見報道，本研究采用光化學(xué)衍生技術(shù)，建立了準確、靈敏、簡便的雞肉中磺胺類殘留的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

磺胺醋酰（純度≥99.5%）、磺胺噻唑（純度≥99.5%）、磺胺吡啶（純度≥99.0%）、磺胺甲基嘧啶（純度≥99.2%）、磺胺二甲惡唑（純度≥98.0%）、磺胺二甲嘧啶（純度≥99.0%）、磺胺甲氧噠嗪（純度≥98.7%）、磺胺氯噠嗪（純度≥99.0%）、磺胺甲惡唑（純度≥99.0%）、磺胺間甲氧嘧啶鈉（純度≥98.5%）、磺胺二甲異惡唑（純度≥98.7%）、磺胺苯吡唑（純度≥99.0%）、磺胺氯吡嗪（純度≥99.0%）、磺胺間二甲氧嘧啶（純度≥99.0%）、磺胺喹惡啉（純度≥98.0%）、磺胺硝苯（純度≥99.0%） 德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；實驗用水超純水；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

525高效液相色譜儀（配2475熒光檢測器） 美國Waters公司；光化學(xué)柱后衍生反應(yīng)器（紫外燈8 W、反應(yīng)管15 m） 新加坡Pribolab公司；IKAT25高速勻漿機、RV-10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國IKA公司；離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；XK80-A快速混勻器 江蘇新康醫(yī)療器械有限公司；AG135型精密電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；優(yōu)普UPE-II-40L型超純水機 成都優(yōu)普超純科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

分別稱取磺胺醋酰6.03 mg、磺胺噻唑6.00 mg、磺胺吡啶6.14 mg、磺胺甲基嘧啶6.13 mg、磺胺二甲惡唑6.05 mg、磺胺二甲嘧啶6.00 mg、磺胺甲氧噠嗪6.07 mg、磺胺氯噠嗪6.04 mg、磺胺甲惡唑6.07 mg、磺胺間甲氧嘧啶鈉6.01 mg、磺胺二甲異惡唑6.11 mg、磺胺苯吡唑6.05 mg、磺胺氯吡嗪6.07 mg、磺胺間二甲氧嘧啶6.03 mg、磺胺喹惡啉6.08 mg、磺胺硝苯6.04 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成磺胺醋酰603 μg/mL、磺胺噻唑600 μg/mL、磺胺吡啶614 μg/mL、磺胺甲基嘧啶613 μg/mL、磺胺二甲惡唑605 μg/mL、磺胺二甲嘧啶600 μg/mL、磺胺甲氧噠嗪607 μg/mL、磺胺氯噠嗪604 μg/mL、磺胺甲惡唑607 μg/mL、磺胺間甲氧嘧啶鈉601 μg/mL、磺胺二甲異惡唑611 μg/mL、磺胺苯吡唑605 μg/mL、磺胺氯吡嗪607 μg/mL、磺胺間二甲氧嘧啶603 μg/mL、磺胺喹惡啉608 μg/mL、磺胺硝苯604 μg/mL的標準溶液。分別吸取上述標準溶液各100 mL配成標準混合液，用時用甲醇稀釋成一系列質(zhì)量濃度的標準溶液。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Platisil ODS（4.6 mm×250 mm， 5 μm）；流動相：0.3%冰乙酸（A）-甲醇（B）；梯度洗脫（0～32 min，8%～40% B；32～39 min，40%～50% B；39～41 min，50%～60% B；41～48 min，60%～60% B；48～55 min，60%～8% B）；流速0.7 mL/min；柱溫36 ℃；進樣量10 μL；熒光檢測器：激發(fā)波長320 nm，發(fā)射波長450 nm。

1.3.3 樣品前處理

稱取5.0 g（精確至0.01 g）雞肉，置于50 mL離心管中，加入5 g無水硫酸鈉和20 mL乙腈，勻質(zhì)2 min，以4 000 r/min離心5 min，上清液倒入100 mL燒瓶中，殘渣再加入20 mL乙腈，重復(fù)上述操作一次。合并提取液，加入10 mL異丙醇，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器于50 ℃水浴蒸干，準確加入1 mL甲醇和1 mL正己烷溶解殘渣，轉(zhuǎn)移至5 mL離心管中，渦旋1 min，以3 000 r/min離心5 min，吸取上層正己烷棄去，再加入1 mL正己烷，重復(fù)上述步驟，直至下層水相變成透明液體，過0.45 μm濾膜，濾液進行高效液相色譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 光化學(xué)在線衍生反應(yīng)

磺胺類藥物本身并不發(fā)熒光，不能用熒光檢測器直接檢測，通常需要與熒光試劑進行柱前或柱后反應(yīng)衍生上熒光基團從而被檢測[23-26]。光化學(xué)在線衍生反應(yīng)與之相比不需要額外的衍生試劑，沒有引入其他雜質(zhì)，顯現(xiàn)出更好的發(fā)展前景。不同取代基的磺胺類藥物對光化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)不同[26]，因此其熒光強度也不同，綜合比較磺胺類藥物在不同波長條件下的譜圖確定激發(fā)波長為320 nm，激發(fā)波長為450 nm。

不同磺胺類藥物在同一濃度時發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)后熒光強度差別較大，根據(jù)其檢出限的不同將之前配好的16 種標準溶液配制成熒光強度大概相同的標準混合液，即磺胺醋酰110.28 μg/mL、磺胺噻唑51.38 μg/mL、磺胺吡啶8.20 μg/mL、磺胺甲基嘧啶9.66 μg/mL、磺胺二甲惡唑17.1 μg/mL、磺胺二甲嘧啶9.64 μg/mL、磺胺甲氧噠嗪3.68 μg/mL、磺胺氯噠嗪2.12 μg/mL、磺胺甲惡唑18.62 μg/mL、磺胺間甲氧嘧啶鈉20.22 μg/mL、磺胺二甲異惡唑39.28 μg/mL、磺胺苯吡唑23.4 μg/mL、磺胺氯吡嗪2.40 μg/mL、磺胺間二甲氧嘧啶13.12 μg/mL、磺胺喹惡啉1.14 μg/mL、磺胺硝苯8.98 μg/mL，標準混合液在光化學(xué)反應(yīng)前后的比較見圖1，在光化學(xué)反應(yīng)器未開啟時，只有磺胺甲氧噠嗪有較弱的熒光響應(yīng)信號；光化學(xué)反應(yīng)器開啟后，各種藥物均有熒光信號且信號強度明顯增強。

圖1 光化學(xué)反應(yīng)前（A）、后（B）16 種磺胺的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of 16 sulfonamides before (A) and after (B) on-line photochemical derivatization

2.2 色譜分離條件選擇

磺胺類藥物含有堿基，具有弱堿性，流動相的酸堿度對分離度具有較大影響。本實驗考察了水溶液和不同體積分數(shù)乙酸溶液做流動相時對16 種化合物分離效果的影響。結(jié)果表明，當水-甲醇溶液為流動相體系時，只有極少數(shù)化合物能夠分開且峰形基本拖尾；流動相酸度過高時，16 種化合物不能完全分開；酸度過低時，會呈現(xiàn)明顯的峰拖尾，展寬現(xiàn)象。綜合考慮，選擇0.3%乙酸-甲醇溶液做流動相，通過梯度洗脫可使16種化合物完全分離，且峰形尖銳對稱。

2.3 精密度實驗結(jié)果

將配制的混合標準溶液稀釋5 倍后連續(xù)進樣6 次，根據(jù)所得峰面積和保留時間分別計算精密度，16種磺胺藥物峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）范圍在1.60%～4.56%之間，保留時間的RSD在0.02%～0.55%之間，表明該方法精密度良好。

2.4 線性范圍、檢出限、定量限

表1 16種磺胺類藥物的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table1 Linear ranges, regression equations，correlation coeffi cients, LOD and LOQ of 16 sulfonamides

準確移取不同質(zhì)量濃度的磺胺標準混合溶液，在選定的最佳色譜分離條件下分離測定，對各測得值進行相關(guān)系數(shù)分析和線性回歸分析，結(jié)果見表1。結(jié)果表明：16 種磺胺藥物在0.13～67.89 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，線性良好（R≥0.994 0）。以3 倍信噪比（RSN= 3）計算方法的檢出限，以10 倍信噪比（RSN= 10）計算方法的定量限，同時參照國標常用的紫外檢測法按上述方法計算方法的檢出限，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，16 種磺胺類藥物的定量限在3.3～224.6 μg/kg范圍內(nèi)，雖然磺胺醋酰的靈敏度不能滿足磺胺類藥物殘留的檢測要求，但是其他大部分均集中在10～60 μg/kg范圍內(nèi)，檢出限為1.0～67.4 μg/kg，可以看出，本實驗采用的方法明顯的提高了方法的靈敏度。

2.5 回收率實驗結(jié)果

取陰性雞肉樣品進行加標回收率實驗，空白樣品與加標樣品見圖2，其結(jié)果見表3。從表3可知，本方法中磺胺類藥物在各自的添加水平0.03～4.49 μg/mL范圍內(nèi)，每個添加水平重復(fù)3次，其平均回收率在61.2%～106.6%之間，RSD為0.3%～13.9%。

圖2 空白雞肉樣品（A）和加標樣品（B）高效液相色譜圖Fig.2 High performance liquid chromatograms of blank and spiked samples

表3 肉中16 種磺胺的加標回收率結(jié)果Table3 Recoveries for the 16 sulfonamides in chicken

2.6 實際樣品分析

取購于本地超市的10 個雞肉樣品用本方法進行16 種磺胺類藥物的殘留檢測。在10 個樣品中均未檢測到磺胺類藥物殘留，雞肉樣品典型色譜圖見圖3。

3 結(jié) 論

本實驗通過色譜條件的優(yōu)化，并經(jīng)過檢出限、精密度、回收率等方法學(xué)的考察，建立了一種高效液相色譜-光化學(xué)在線衍生-熒光檢測法測定雞肉中16 種磺胺類藥物殘留的分析方法。該方法采用柱后光化學(xué)衍生反應(yīng)器實現(xiàn)了在線檢測，提高了方法的靈敏度，相比于其他化學(xué)試劑衍生法，綠色、環(huán)保、不引入其他的雜質(zhì)，操作簡便、精密度好，與通常檢測磺胺類藥物的國標方法進行對比，本實驗大大的提高了磺胺類藥物的檢測靈敏度，適用于雞肉產(chǎn)品中磺胺類藥物殘留的檢測，但是本實驗所檢測的16 種磺胺類藥物并不是所有的都能達到較高的靈敏度，其中磺胺醋酰的定量限為224.6 μg/kg，并不能滿足磺胺類殘留檢測的限定，且因不同的磺胺類藥物其熒光強度不同，這也就導(dǎo)致本實驗所檢測的16 種磺胺類藥物間適用線性范圍差別較大，對今后的檢測應(yīng)用存在一定程度的影響，有待于進一步優(yōu)化實驗過程提高其方法的靈敏度，減少對因藥物種類的差別對實際應(yīng)用的影響。

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Determination of 16 Sulfonamide Residues in Chicken by High Performance Liquid Chromatography with Online Photochemical Derivatization and Fluorescence Detection

XU Xu1,2, GENG Dandan1,2, CHI Xiaofeng1, DONG Qi1, HU Fengzu1,*, XIAO Yuancan1,*
(1. Northwest Institute of Plateau Biology, Chinese Academy of Sciences, Xining 810008, China; 2. College of Life Science, University of Chinese Academy of Science, Beijing 100049, China)

A high performance liquid chromatography (HPLC) with online postcolumn photochemical derivatization and fl uorescence detection (FLD) method was established for the determination of 16 sulfonamide residues in chicken. Chicken samples were extracted with acetonitrile and the extract was defatted, separated by column chromatography, treated by online photochemical derivatization and detected using a fl uorescence detector. The mobile phase was a mixture of 0.3% glacial acetic acid and methanol solution at a fl ow rate of 0.7 mL/min. The column temperature was set as 36 ℃, and the excitation and emission wavelengths were set as 320 and 450 nm, respectively. The 16 sulfonamide residues were successfully separated and determined under chosen experimental conditions. The calibration curves showed good linearity in the range of 0.13-67.89 μg/mL (R ≥ 0.994 0). The recovery rates of the 16 sulfonamide residues were in the range of 64.3%-106.6% with relative standard deviation (RSD) of 0.3%-13.9%.The limits of detection (LOD) for the sulfonamides were 1-67.4 μg/kg. The established method is sensitive, accurate, rapid, and suitable for the determination of sulfonamide residues in chicken.

chicken; sulfonamides; online photochemical derivatization; HPLC-FLD

TS207.3

A

1002-6630（2015）22-0165-04

10.7506/spkx1002-6630-201522031

2015-01-19

中國科學(xué)院儀器功能開發(fā)技術(shù)創(chuàng)新項目（Ig201308）；中國科學(xué)院知識創(chuàng)新工程重要方向項目（KSCX2-EW-J-26）；

青海省科技平臺建設(shè)項目（2012-T-Y19）

許旭（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品安全檢測。E-mail：xuxu5286@126.com

*通信作者：胡風(fēng)祖（1955—），女，研究員，本科，研究方向為應(yīng)用化學(xué)。E-mail：hufz@nwipb.cas.cn

肖遠燦（1980—），男，工程師，碩士，研究方向為食品及藥品分析。E-mail：ycxiao@nwipb.cas.cn