王歡利，劉新亮，郁萬文，李廣平，曹福亮

（南京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心， 江蘇 南京 210037）

銀杏葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因（GbLhcb4）及其啟動(dòng)子克隆

王歡利，劉新亮，郁萬文，李廣平，曹福亮

（南京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心， 江蘇 南京 210037）

為了探究銀杏中葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因（GbLhcb4）的結(jié)構(gòu)及其相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，基于Roche 454高通量測(cè)序獲得的GbLhcb4基因片段，采用RACE技術(shù)分離得到該基因的cDNA序列，并通過染色體步移技術(shù)獲得該基因啟動(dòng)子序列，結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)分析基因序列的特征、系統(tǒng)進(jìn)化地位及啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。序列分析表明，GbLhcb4基因全長1 200 bp，含有一個(gè)834 bp開放閱讀框，編碼277個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為30.65 kD，等電點(diǎn)為5.17。同源分析表明，該基因編碼蛋白與北美云杉PsLhcb4蛋白（GenBank登錄號(hào)：ABK21281.1）相似性最高，為74.7%。啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)表明，啟動(dòng)子區(qū)域包含多個(gè)光響應(yīng)元件及逆境響應(yīng)元件，同時(shí)還存在激素響應(yīng)、組織特異性表達(dá)、細(xì)胞周期等相關(guān)調(diào)控元件。此研究分離得到銀杏GbLhcb4基因及啟動(dòng)子序列，并進(jìn)行了相關(guān)的生物信息學(xué)分析，為探究銀杏GbLhcb4基因應(yīng)答環(huán)境信號(hào)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制提供了分子基礎(chǔ)。

銀杏；葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因；啟動(dòng)子分離；RACE技術(shù)

光合作用產(chǎn)物是人類賴以生存和發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此植物光合作用的研究一直是生物學(xué)的研究熱點(diǎn)。在高等植物中，捕光葉綠素a/b結(jié)合 蛋 白（Light-harvesting chlorophyll a/b-binding proteins，LhcPs）是光合作用中的重要功能蛋白與葉綠素a/b 形成復(fù)合體，將光能迅速傳到光系統(tǒng)I（PS I）和光系統(tǒng)II（PS II）的反應(yīng)中心，使光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能，促進(jìn)光合反應(yīng)的進(jìn)行[1]。LhcPs在類囊體膜上的含量最為豐富，其結(jié)合的葉綠素約占類囊體膜上色素量的50%。研究發(fā)現(xiàn)編碼LhcPs的同源基因定位于細(xì)胞核，分屬于10個(gè)基因家族。PS I包含4種捕光色素蛋白，分別由Lhca1、Lhca2、Lhca3和Lhca4編碼；PS II包含3種主要捕光色素蛋白（major Lhc II），分別由Lhcb1、Lhcb2和Lhcb3編碼，以及3種次要捕光色素蛋白（minor Lhc II)，分別由Lhcb4（CP29）、Lhcb5（CP24）和Lhcb6（CP26）編碼[2]。主要捕光色素蛋白具有高度的同源性，形成同源或異源三聚體；次要捕光色素蛋白大多以單體的形式存在，包括PSII內(nèi)部天線葉綠素a/b結(jié)合復(fù)合體CP29、CP26和CP24，較主要捕光色素蛋白更靠近PS II反應(yīng)中心[3]。主要和次要捕光色素蛋白復(fù)合體構(gòu)成PS II外周捕光天線，其功能主要有以下四個(gè)方面：傳遞和捕獲光能；分配和平衡 PS II和 PS I 中的能量；光保護(hù)和過剩能量耗散；維持類囊體膜的結(jié)構(gòu)[4-8]。

自20世紀(jì)末期至今已有少數(shù)植物的Lhcb基因被相繼克隆，如擬南芥[9-10]、小麥、水稻[11]、毛竹[12]、長白松[13]、銀杏[14-16]、大麥[3]、葡萄[17]、花椰菜[18]、蘿卜、羽衣甘藍(lán)、鹽生杜氏藻[19]等。此外有研究表明在低溫、高鹽、干旱及病害的條件下Lhc基因表達(dá)下調(diào)[3]。目前NCBI公布的銀杏Lhc基因?yàn)镚bLhcb1，而另幾種Lhc基因還未見報(bào)道[17]。本研究基于銀杏葉片高通量測(cè)序的基礎(chǔ)上，根據(jù)基因注釋結(jié)果為Lhcb4的基因片段設(shè)計(jì)5′ 及3′ 引物，利用RACE技術(shù)擴(kuò)增GbLhcb4基因全長序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析；同時(shí)應(yīng)用染色體步移技術(shù)擴(kuò)增GbLhcb4基因的啟動(dòng)子區(qū)域，進(jìn)而分析有關(guān)的調(diào)控元件，目的在于豐富Lhcb基因家族成員，以便進(jìn)一步了解Lhcb家族基因在不同植物中的結(jié)構(gòu)、功能及其表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 材 料

銀杏葉片于2012年4月下旬采自南京林業(yè)大學(xué)銀杏園，葉片經(jīng)酒精擦拭后，液氮速凍，-80 ℃保存。

SmarterTMRACE cDNA Amplification Kit、Advantage 2 Polymerase Mix和Genome WalkerTMUniversal Kit購自clontech公司。各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、ExTaq DNA聚合酶、PMD-18T 載體、DNA凝膠純化回收試劑盒均購自大連寶生物工程公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。試驗(yàn)中所選用的引物序列及反應(yīng)程序參考表1和表2。引物序列交由上海捷瑞生物工程有限公司合成。基因測(cè)序由上海美吉生物工程有限公司完成。

表2 PCR擴(kuò)增程序Table 2 Amplification program of PCR

1.2 方 法

1.2.1 RNA及DNA的提取

葉片總RNA的提取采用CTAB法[20]，DNA的提取參考魏春紅等[21]的改良CTAB法。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)核酸的完整性并用紫外分光光度計(jì)（UV2102，UNICO）檢測(cè)核酸的濃度。

1.2.2 cDNA的合成

反轉(zhuǎn)錄cDNA合成采用Takara公司的Prime ScriptTM第一鏈cDNA合成試劑盒5' RACE和3'RACE反轉(zhuǎn)錄cDNA模板合成參考Clontech公司的SmarterTMRACE cDNA Ampli fication Kit說明書操作。

1.2.3 RACE反應(yīng)及基因全長的獲得

RACE PCR 使用巢式PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增程序參見Clontech公司的SmarterTMRACE cDNA Ampli fication Kit說明書。反應(yīng)過程采用clontech公司的Advantage 2 Polymerase Mix基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，采用Agarose Gel DNA puri fieation Kit回收目的片段，亞克隆至PMD-18 T Vector中，熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌后測(cè)序。

1.2.4 GbLhcb4基因全長及基因組序列的擴(kuò)增

擴(kuò)增選用Takara公司的ExTaq DNA聚合酶。引物序列及反應(yīng)程序參見表1和表2。

1.2.5 啟動(dòng)子的克隆及測(cè)序

基因啟動(dòng)子參考Clontech公司的Genome WalkerTMUniversal Kit 說明書?；蚪M酶切選用平末端限制酶DraI、EcoRV、PvuII和StuI酶切12 h，分別純化回收；回收產(chǎn)物與Genome WalkerTMUniversal Kit 試劑盒提供的接頭連接，16 ℃條件下連接過夜，連接產(chǎn)物稀釋10 倍，置于-20 ℃保存，作為步移PCR 擴(kuò)增模板。步移中使用到兩組巢式引物AP1、Lhcb4 gsp1及AP2、Lhcb4 gsp1（見表1）。擴(kuò)增序列連接到pMD18-T 載體并測(cè)序。

1.2.6 生物信息學(xué)分析

用生物信息學(xué)序列比對(duì)軟件Vector NTI Suite 11.5進(jìn)行不同物種間同源基因的核苷酸序列比對(duì)、測(cè)序片段的拼接。采用Primer Premier 5.0和Oligo 6生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)引物。利用BlastP（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/） 進(jìn) 行 同源 性 搜 索。ProtParam （http：//au.expasy.org/tools/protparam.html）計(jì)算蛋白的分子量及等電點(diǎn)。Signal P4. 1 Server （http：∥ www. cbs. dtu. dk /services / SignalP）預(yù)測(cè)信號(hào)肽及剪切位點(diǎn)。蛋白質(zhì)的疏水性和跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分別采用ProtScale Server（http：//www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl） 和 TMHMM Server Version 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）。使用植物調(diào)控元件 分 析 軟 件 PLACE（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/） 及 PlantCare（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）對(duì)克隆的啟動(dòng)子序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件預(yù)測(cè)。用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）和 MOTIFSCAN（http：//prosite.expasy.org/）等軟件對(duì)GbLhcb4蛋白的功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。依據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫提供的已發(fā)布Lhcb氨基酸序列，結(jié)合銀杏GbLhcb序列，用MEGA5.03提供的近鄰相接法（Neighbor-Joining Tree）繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。進(jìn)化樹各節(jié)點(diǎn)處數(shù)字表示bootstrap值，重復(fù)1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 GbLhcb4 cDNA 的克隆及序列分析

測(cè)序結(jié)果拼接后得到1 200 bp全長序列（GeneBank登錄號(hào)：KC818609），包含一個(gè)834 bp 最大讀碼框（ORF）；blast分析結(jié)果顯示該基因與植物L(fēng)hcb4基因序列有較高的同源性，因此，將銀杏中該基因定義為GbLhcb4。序列分析表明，GbLhcb4含有保守的植物基因翻譯起序列AACAATGG，與Lutcke等[22]統(tǒng)計(jì)的植物基因翻譯起始序列一致。GbLhcb4編碼1條278個(gè)氨基酸殘基的多肽（見圖1），預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為30.65 kD，等電點(diǎn)為5.17。SignalP預(yù)測(cè)顯示GbLhcb4蛋白質(zhì)不存在信號(hào)肽序列。蛋白疏水性和跨膜結(jié)構(gòu)顯示，GbLhcb4可能存在3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，分位于142～164、179～201和246～263氨基酸段朝向類囊體膜內(nèi)，羧基端朝向基質(zhì)一側(cè)（見圖2）。

用SMART和MOTIFSCAN在線分析軟件對(duì)GbLhcb4基因編碼的氨基酸進(jìn)行分析，顯示第64～261位包括一個(gè)典型的捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白功能域（chlorophyll a/b binding domain）；第 24～ 26，53～ 55，263～ 265和 276～ 278位為蛋白激酶C的磷酸化位點(diǎn)（Protein kinase C phosphorylation site），蛋白激酶C 是G 蛋白偶聯(lián)受體系統(tǒng)中的效應(yīng)物，在非活性狀態(tài)下是水溶性的，游離存在于胞質(zhì)溶膠中，激活后成為膜結(jié)合的酶；第70～75，107～112和150～155位為N-肉豆蔻酰位點(diǎn)（N-myristoylation site）；第22～25，23～26和187～190位為N-糖基化位點(diǎn)（N-glycosylation site）（見圖1）。

GbLhcb4氨基酸序列與北美云杉Picea sitchensis（ABK21281.1） 的 同 源 性 最 高，為74.7%；而與傘藻Acetabularia acetabulum（DAA05897.1 ）的同源性最低，為46.3%；與蓖 麻Ricinus communis（XP_002528105.1）、 陸地棉Gossypium hirsutum（ACO51068.1）、毛果楊Populus trichocarpa（XP_002323575.1）、 綠豆Vigna radiata（AAD27878.1）、玉米Zea mays（NP_001105502.1）、擬南芥Arabidopsis thaliana（NP_181539.1）和小立碗蘚Physcomitrellapatenssubsp. Patens（XP_001785452.1）相似性為64.7%～69.9%（見圖3）。

圖1 GbLhcb4基因核酸和編碼氨基酸序列及啟動(dòng)子序列Fig. 1 Gene nucleic acid, encoded amino acid sequences and promoter sequence of GbLhcb4

2.2 GbLhcb4 進(jìn)化樹分析

采用近鄰相接法（Mega5.03）對(duì)不同植物L(fēng)hcb的氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Lhcb4蛋白的進(jìn)化獨(dú)立其他5類Lhcb蛋白。其中植物L(fēng)hcb4氨基酸根據(jù)所選物種分為5組（見圖3）：藻類植物、苔蘚類植物、裸子植物、單子葉植物和雙子葉植物。其中單子葉植物玉米、水稻和毛竹等為一組，分化時(shí)間最遲，集中在0.01～0.03；雙子葉植物龍眼、蓖麻、陸地棉和擬南芥等為一組，銀杏和北美云杉作為裸子植物一組，集中在0.02～0.14；小立碗蘚作為較原始的苔蘚類植物單獨(dú)為一組，分歧時(shí)間大約為0.2；傘藻作為更原始的藻類植物單獨(dú)為一組，分歧時(shí)間最早。

2.3 GbLhcb4 內(nèi)含子序列分析

克隆的基因片段測(cè)序結(jié)果顯示，GbLhcb4基因DNA序列長度為1 192 bp，與GbLhcb4基因cDNA序列相比，該基因包含2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子（見圖1）。

2.4 啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)和序列分析

經(jīng)過2輪PCR，從銀杏基因組DNA的PvuII酶切體系中擴(kuò)增一條位于750～1 000 bp之間的目的條帶。將目的片段回收亞克隆后直接測(cè)序，結(jié)果表明，目的片段實(shí)際長度為766 bp。利用Vector NTI Suite 11.5軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)，該序列中包含有15 bp的GbLhcb4基因編碼區(qū)、89 bp的5'-UTR區(qū)和662 bp的基因啟動(dòng)子區(qū)（見圖1）。

圖2 Lhcb4 氨基酸序列多重對(duì)比分析Fig.2 Multiple comparative analyses of Lhcb4 amino acid sequences

圖3 采用MEGA5.03構(gòu)建植物L(fēng)hcb4蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 3 Phylogenetic tree of Lhcb4 protein system constructed by MEGA5.03

利用在線軟件PLACE和PlantCARE對(duì)GbLhcb4基因啟動(dòng)子序列中可能含有的順式作用元件進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該段序列含有3個(gè)拷貝的CAATBOX和4拷貝的TATABOX。除此之外該啟動(dòng)子區(qū)域還具有22個(gè)光響應(yīng)元件（ACE，CGACGDSAMY3，GATABOX，GBOX，GT1CONSENSUS，IBOX，REALPHALGLhcb21，SORLIP1AT，SORLIP2AT）、26個(gè) 逆 境 脅 迫響 應(yīng) 元 件（ACGTATERD，CCAATBOX1，C U R E C O R E C R，D O F C O R E Z M，GT1GMSCAM4，MYB1AT，MYBPZM，M Y B 2 C O N S E N S U S，P RE AT P R O D H，SURECOREATSULTR11，UPRMOTIFIAT，WRKY71O，WUNMOTIF）、6個(gè)激素響應(yīng)順式作用元件（ARFAT，ARR1AT，CGTCAMOTIF，MYB1AT，MYB2CONSENSUS，WRKY71O）（見表3）；3個(gè)組織特異性表達(dá)元件包括1個(gè)葉肉組織特異性表達(dá)元件（CACTFTPPCA1）、1個(gè)K離子通道調(diào)節(jié)組織特異表達(dá)元件（TAAAGSTKST1）和1個(gè)MYB識(shí)別位點(diǎn)（MYBPZM），2個(gè)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)的元件（E2FCONSENSUS，HEXMOTIFTAH3H4），1個(gè)葉綠體核糖體蛋白基因負(fù)性調(diào)節(jié)元件（S1FBOXSORPS1L21）（見表3）。

表3 GbLhcb4啟動(dòng)子區(qū)域主要順式作用元件分析Table 3 Some important cis-acting regulatory elements in promoter sequence of GbLhcb4

3 討 論

本研究從古老的裸子植物銀杏中分離得到捕光葉綠素 a/b 結(jié)合蛋白基因GbLhcb4，序列分析結(jié)果表明GbLhcb4基因與高等植物L(fēng)hcb4基因具較高的相似性，顯示了Lhcb4進(jìn)化過程中的保守性。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，GbLhcb4在進(jìn)化上分化較早，僅次于傘藻和小立碗蘚，而與裸子植物北美云杉具有相近的分化時(shí)間，這與物種由簡(jiǎn)單到復(fù)雜的進(jìn)化理論相一致。蛋白序列分析結(jié)果顯示：此蛋白含有3個(gè)跨膜區(qū)域和1個(gè)葉綠素a/b結(jié)合位點(diǎn)，此研究表明Lhcb4可能是一類膜蛋白，執(zhí)行與色素分子結(jié)合的功能[21]；4個(gè)蛋白激酶C的磷酸化位點(diǎn)可能與調(diào)節(jié)Lhc蛋白的光合磷酸化過程相關(guān)，完成PS I和PS II之間的轉(zhuǎn)換，從而使兩個(gè)系統(tǒng)的光能利用達(dá)到平衡[24-25]；3個(gè)N-豆蔻?；稽c(diǎn)和3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)這可能與蛋白質(zhì)翻譯后修飾有關(guān)。

此外，啟動(dòng)子的克隆和順式作用元件分析是進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究和基因功能分析的前提。目前許多學(xué)者對(duì)Lhc基因進(jìn)行了研究，研究結(jié)果表明Lhc基因的表達(dá)不僅受光[26]和晝夜節(jié)律[27]的調(diào)控， 而且還受到植物不同的發(fā)育階段[27-28]與激素水平[10,24,29]及外界環(huán)境因子[30-31]的影響。然而，不同Lhc基因的誘導(dǎo)條件存在一定差異，但是控制Lhc基因特異性表達(dá)的機(jī)制還未得到系統(tǒng)的揭示。銀杏GbLhcb4啟動(dòng)子序列分析發(fā)現(xiàn)，其存在多種光響應(yīng)、逆境響應(yīng)、激素響應(yīng)、組織特異性表達(dá)、細(xì)胞周期和葉綠體核糖體蛋白基因負(fù)性調(diào)節(jié)元件。本研究分離到的銀杏GbLhcb4基因及其啟動(dòng)子序列，為開展銀杏GbLhcb4基因功能及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理的研究，揭示Lhcb4基因響應(yīng)環(huán)境信號(hào)的分子機(jī)制提供了遺傳基礎(chǔ)。

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Cloning of light-harvesting cholorophyll a/b-binding protein coding gene(GbLhcb4) and promoter sequence fromGinkgo biloba

WANG Huan-li, LIU Xin-liang, YU Wan-wen, LI Guang-ping, CAO Fu-liang
(Collaborative Innovation Center of Southern Modern Forestry, College of Forestry, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037,Jiangsu, China)

In order to explore structure and cis-regulatory elements of the gene of light-harvesting cholorophyll a/b-binding proteins in ginkgo (GbLhcb4), full-length cDNA sequence and promoter ofGbLhcb4 were cloned from ginkgo by using method of rapid ampli fication of cDNA ends and genome walking methods respectively, which based on the fragment ofGbLhcb4 acquired by Roche 454 high-throughput sequencing. The sequence analysis indicated that the length ofGbLhcb4 (GenBank number： KC818609) was 1200 bp, which contained a 834 bp open reading frame and encoded a 277 aa protein, with a predicted molecular weight of 30.65 kD and the isoelectric point of 5.17. Multiple alignment of deduced amino acid sequence showed that it had the highest sequence similarity,approximately 74.7% similarity with other Lhcb4 inPicea sitchensis. Cis-regulatory elements analysis revealed that light responsiveness elements, stress responsiveness, phytohormone responsiveness and tissue-speci fic cis-regulatory elements was in the promoter region ofGbLhcb4. The full-length sequence and promoter ofGbLhcb4 were obtained in this research and the structure andcis-elements were analyzed by a series of bioinformatics soft-wares. It will be helpful to understand the transcriptional regulatory mechanism ofGbLhcb4,when ginkgo responded to environment signals.

Ginkgo biloba; chlorophyll a/b binding protein gene (GbLhcb4); promoter isolation; RACE technologies separation

S792.95；Q786

A

1673-923X(2015)05-0114-08

10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.05.020

2014-02-10

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31170627）；江蘇省自然基金項(xiàng)目（BK2010019）；江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（CXZZ12_0546）；南京林業(yè)大學(xué)優(yōu)秀博士學(xué)位論文創(chuàng)新基金項(xiàng)目

王歡利，博士生

曹福亮，教授；E-mail：samcaoster@gmail.com

王歡利,劉新亮,郁萬文,等. 銀杏葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因（GbLhcb4）及其啟動(dòng)子克隆[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào), 2015,35(5)： 114-121.

[本文編校：謝榮秀]