張玉鎮(zhèn) 婁季宇△ 楊霄鵬 曾志磊 王珊珊 劉新珊 張曉明 尹紅蕾 王運(yùn)良

1）鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450014 2）解放軍第一四八中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 淄博 255300 3）解放軍第一五九中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 駐馬店 463000

近年來，細(xì)胞移植治療帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）已吸引許多研究者的關(guān)注［1］，而人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord，hUC-MSC）因具備較多的優(yōu)點(diǎn)已成為優(yōu)先修復(fù)PD的種子細(xì)胞之一［2］。同時(shí)肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）作為一個(gè)多功能的生長因子，參與多種細(xì)胞的分化、增殖、再生、遷移及形態(tài)的發(fā)生，包括hUC-MSC［3］。據(jù)Salehi等［4］報(bào)道，HGF可能參與了帕金森病的病理生理過程。因此，將hUC-MSC和HGF結(jié)合可能會(huì)成為治療PD的一種新型方法。

本研究將hUC-MSC分離并鑒定后，感染攜帶肝細(xì)胞生長因子基因的腺病毒載體（adenoviral vector carrying HGF gene，Ad-HGF），觀察hUC-MSC內(nèi)酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）和多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體（Dopamine transporter，DAT）的表達(dá)情況，以明確在HGF過表達(dá)的情況下，hUCMSC是否有類多巴胺神經(jīng)元分化的潛能，為HGF基因修飾hUC-MSC治療PD提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 攜帶綠色熒光蛋白基因的重組腺病毒毒株Ad-GFP由美國百特醫(yī)療用品公司基因治療部提供，攜帶HGF的重組腺病毒毒株Ad-HGF由本室構(gòu)建；臍帶組織取自我院住院的健康產(chǎn)婦，所有標(biāo)本的獲得均經(jīng)產(chǎn)婦知情同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。F12培養(yǎng)基購自美國Gibco公司。DA ELISA試劑盒購自德國IBL公司。所有的抗體均購自美國R＆D公司。

1.2 方法

1.2.1 hUC-MSC分離培養(yǎng)和鑒定：足月健康新生兒臍帶用無血清F12培養(yǎng)基清洗殘余血液，挑出臍動(dòng)靜脈后，將剩余組織剪成約2mm的組織塊，再轉(zhuǎn)至離心管中，用無血清培養(yǎng)基清洗數(shù)遍以去除臍帶組織表面的黏液，后轉(zhuǎn)移至25cm2的培養(yǎng)瓶中，添加10%胎牛血清和雙抗的F12培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中5%CO2，37℃培養(yǎng)，待細(xì)胞從組織塊周圍爬出進(jìn)行傳代培養(yǎng)，只取3～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

將細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基洗滌3次后，胰酶消化制成細(xì)胞懸液（1×106mL-1），取0.1mL加入每個(gè)離心管中，再加入CD44、CD29和CD105一抗，并在黑暗條件下4℃孵育30min；然后加入熒光標(biāo)記的二抗，同樣條件下孵育30min。甲醛溶液固定后，用流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson公司）和CellQuest軟件分析細(xì)胞表面是否表達(dá)CD44、CD29和CD105。

1.2.2 重組腺病毒轉(zhuǎn)染hUC-MSC后轉(zhuǎn)染效率的測定：將hUC-MSC接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔5×105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞生長融合至80%左右，吸出原來的培養(yǎng)液，用無血清無雙抗的F12洗滌3遍，分別加入MOI為50、100、150、200和400的Ad-GFP，以F12做為對(duì)照，2h后棄掉病毒液，換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48h后收取細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 細(xì)胞免疫酶化學(xué)方法檢測TH和DAT的表達(dá)：將無菌蓋玻片置于細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，Ad-HGF感染細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)，將玻片取出；磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗3×2min；4%多聚甲醛處理（室溫）20min；PBS漂洗3×2min；0.5%Txiton X-100處理（室溫）20min；PBS漂洗3×2min；3%H2O2處理15min；試劑盒中的血清封閉液，37℃封閉20min；取出甩干封閉液后加一抗，陰性對(duì)照用PBS代替一抗，37℃1～2 h或4℃過夜；PBS漂洗3×2min；加生物素標(biāo)記的二抗37℃孵育30min；PBS漂洗3×2min；DAB顯色2～10min，蘇木素復(fù)染觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較采用單因素方差分析，所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫組化結(jié)果運(yùn)用Image-Pro Plus 5.0圖像分析軟件進(jìn)行分析，得到集成光學(xué)密度值（IOD）值后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。

2 結(jié)果

2.1 hUC-MSC分離培養(yǎng)及鑒定 采用組織塊法分離hUCMSC，組織塊貼壁后3～4d后可見少數(shù)細(xì)胞從組織塊周圍爬出，細(xì)胞呈梭形，多角形，可見細(xì)胞核，隨著細(xì)胞增殖，形狀逐漸轉(zhuǎn)向典型的成纖維樣細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞融合至90%左右，細(xì)胞呈平行排列或漩渦狀。然后按1︰2將細(xì)胞傳代。取第3代用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞分子表面標(biāo)志。如圖1所示，分離培養(yǎng)出的hUC-MSC表達(dá)間質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD44和CD105，而不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志CD31和造血細(xì)胞表面抗原CD45。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測hUC-MSC表面CD44、CD29和CD105的表達(dá)情況

流式細(xì)胞儀結(jié)果表明hUC-MSC表達(dá)間質(zhì)干細(xì)胞分子表面標(biāo)志CD44、CD29和CD105，而不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志CD31和造血細(xì)胞表面抗原CD45。

2.2 重組腺病毒可高效感染hUC-MSC 運(yùn)用不同MOI（50、100、150、200和400）的Ad-GFP感染hUC-MSC，48h后流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡檢測感染效率。結(jié)果顯示隨著MOI值的升高，感染效率逐步提高，當(dāng)MOI為200時(shí)感染效率就能達(dá)到99.55%左右，但當(dāng)MOI值為400時(shí)，感染效率也只有99.99%（圖2）。本研究結(jié)果表明，我們構(gòu)建的腺病毒可高效感染hUC-MSC。本著細(xì)胞損傷小，所用腺病毒少，還要高感染效率的原則，接下來的實(shí)驗(yàn)中腺病毒感染MOI值統(tǒng)一為200。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測hUC-MSC感染效率

不同MOI（0、50、100、150、200和400）的Ad-GFP感染細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)48h。流式細(xì)胞儀檢測感染效率。隨著病毒滴度的變化感染效率可達(dá)99.99%。但MOI 200和400組間無明顯差異。

2.3 Ad-HGF感染后hUC-MSC細(xì)胞內(nèi)TH和DAT表達(dá)逐漸增加 hUC-MSC感染Ad-HGF后，連續(xù)觀察3d，如圖3所示，hUC-MSC內(nèi)TH和DAT的表達(dá)逐漸增多，隨著時(shí)間的推移，這種現(xiàn)象越來越明顯，同時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)逐漸改變，轉(zhuǎn)為多邊形和不規(guī)則形，還會(huì)看到有長的突起。對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行圖像分析，隨機(jī)選取10個(gè)視野得到IOD值，再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（圖3），結(jié)果表明對(duì)照組和Ad-HGF組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖3 細(xì)胞免疫酶化學(xué)方法檢測hUC-MSC感染Ad-HGF后TH和DAT的表達(dá)

hUC-MSC感染Ad-HGF后，隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞內(nèi)TH和DAT的表達(dá)逐漸增多，同時(shí)細(xì)胞形態(tài)逐漸改變，轉(zhuǎn)為多邊形和不規(guī)則形，還會(huì)看到有長的突起（如箭頭所示，左邊是TH，右邊是DAT，從上而下依次為0、3、7、10d）。

圖4 圖像分析軟件分析細(xì)胞免疫酶化學(xué)結(jié)果

對(duì)細(xì)胞免疫酶化學(xué)結(jié)果進(jìn)行圖像分析，隨機(jī)選取10個(gè)視野得到IOD值，再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表明對(duì)照組和Ad-HGF組間有顯著性差異（＊P＜0.01，A：TH，B：DAT）。（圖4）。

3 討論

hUC-MSC治療PD成為目前比較感興趣的話題，證據(jù)表明，hUC-MSC移植進(jìn)入患者體內(nèi)后表現(xiàn)出很強(qiáng)的可塑性，一定條件下，可分化成多種功能細(xì)胞。越來越多的資料證實(shí)，細(xì)胞因子、免疫和炎癥反應(yīng)的產(chǎn)物，在帕金森病發(fā)生發(fā)展的過程中起非常重要的作用［5］。HGF作為一種多功能的生長因子，對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的發(fā)育、存活、軸突的生長和導(dǎo)向，以及對(duì)周圍神經(jīng)損傷后神經(jīng)元的保護(hù)、軸突的延長和神經(jīng)纖維的修復(fù)等具有重要作用［6］。Lan等［7］發(fā)現(xiàn)，HGF可調(diào)控多巴胺能神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖和遷移，為治療帕金森綜合征提供新的思路。日本學(xué)者用6-羥多巴胺制作大鼠的帕金森模型，單側(cè)紋狀體內(nèi)注射攜帶HGF基因的質(zhì)粒，并與注射lacZ基因的質(zhì)粒相對(duì)照，24周時(shí)HGF組癥狀明顯減輕，且與劑量有關(guān)。免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組約90%的多巴胺能神經(jīng)元消失，而HGF組僅減少70%左右，提示HGF過表達(dá)可以阻止帕金森大鼠多巴胺能神經(jīng)元的死亡［8］。Salehi等［4］運(yùn)用免疫印跡方法檢測PD和正常人腦脊液及血液中的HGF，發(fā)現(xiàn)2組血液中HGF濃度無明顯差異，而PD患者腦脊液中HGF的濃度遠(yuǎn)高于正常人群，表明HGF參與了PD的病理生理過程。

外源性HGF蛋白在體內(nèi)半衰期短，不易通過血腦屏障。構(gòu)建含HGF基因的腺病毒載體可直接用于感染靶細(xì)胞，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后，外源基因至少持續(xù)表達(dá)2周，同時(shí)不整合入宿主細(xì)胞。因此，Ad-HGF與hUC-MSC結(jié)合將是修復(fù)PD的一種新型方法。本研究中，我們將Ad-HGF轉(zhuǎn)移到hMUMSCs中，重點(diǎn)觀察hMU-MSCs向多巴胺能樣細(xì)胞分化的情況。結(jié)果表明，hMU-MSCs感染Ad-HGF后逐步表達(dá)TH和DAT。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，hMU-MSCs的形狀在慢慢改變，從長梭形向多角形，而且還有一些長的突起，類似于對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的形態(tài)，提示hUC-MSC在HGF的作用下具有向多巴胺能樣神經(jīng)元分化的能力，為HGF基因修飾hUC-MSC治療帕金森病提供一定的細(xì)胞基礎(chǔ)。

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