郭文慧，王錦利，周愛(ài)蓮，林其洋，魏奇，方婷

(福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州350002)

許多細(xì)菌之間存在交流。它們根據(jù)種群密度的改變來(lái)調(diào)整它們的基因表達(dá)。這種現(xiàn)象被稱(chēng)為群體信號(hào)感應(yīng)(quorum sensing，QS)。大量關(guān)于群體感應(yīng)的工作在銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、費(fèi)氏弧菌、哈維氏弧菌、大腸桿菌、霍亂弧菌等致命性病原體中展開(kāi)來(lái)闡明群體感應(yīng)的機(jī)制。研究證明，群體感應(yīng)過(guò)程包含信號(hào)分子的產(chǎn)生、信號(hào)分子在介質(zhì)中的積累至某一闕值濃度、受體識(shí)別信號(hào)分子、根據(jù)信號(hào)－受體復(fù)合體的濃度進(jìn)行大量基因的表達(dá)［1］。

群體感應(yīng)主要存在3種系統(tǒng)。以自體誘導(dǎo)物-1(autoinducer-1，簡(jiǎn)稱(chēng)AI-1)為信號(hào)分子的群體感應(yīng)系統(tǒng)。在這個(gè)系統(tǒng)中，一些革蘭氏陽(yáng)性菌以小肽(autoinducer peptide)作為信號(hào)分子;革蘭氏陰性菌尤其是一些重要的病原菌通常以高絲氨酸內(nèi)酯(N-acyl-homoserine lactonase，AHLs)分子作為信號(hào)分子，這些細(xì)菌中通常存在lu xI基因或lu xR基因［2］。以自體誘導(dǎo)物-2(autoinducer-2，簡(jiǎn)稱(chēng) AI-2)為信號(hào)分子的群體感應(yīng)系統(tǒng)在海洋生物發(fā)光細(xì)菌哈維氏弧菌中被發(fā)現(xiàn)，是最普遍的群體感應(yīng)系統(tǒng)。該系統(tǒng)信號(hào)分子的前體物質(zhì)為4，5-二羥基-2，3-戊二酮(4，5-dihydroxy-2，3-pentanedione，簡(jiǎn)稱(chēng) DPD)。DPD是由S-腺苷高半胱氨酸經(jīng)兩步酶促反應(yīng)合成的［3］。相似地，在以自體誘導(dǎo)物-3(autoinducer-3，簡(jiǎn)稱(chēng) AI-3)為群體感應(yīng)的細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)也存在兩種激酶。但是，其信號(hào)分子還未被準(zhǔn)確確定，其結(jié)構(gòu)可能與兒茶酚胺類(lèi)相似［4］。

近年來(lái)，相關(guān)研究證明群體感應(yīng)抑制劑可以調(diào)節(jié)細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)，控制細(xì)菌生物膜的形成、毒力的產(chǎn)生等代謝過(guò)程［5］，從而抑制細(xì)菌在物體表面的生長(zhǎng)和繁殖，達(dá)到控制污染的目的。大量研究在篩選群體感應(yīng)抑制劑和研究其作用機(jī)制中展開(kāi)。為此，筆者簡(jiǎn)單概括了自體誘導(dǎo)物確定的方法和理想群體感應(yīng)抑制劑所需具備的條件，主要介紹了4種有群體感應(yīng)抑制效用的植物精油，并且總結(jié)了多種有效的群體感應(yīng)抑制劑。

1 自體誘導(dǎo)物的確定

通常使用根癌農(nóng)桿菌NTL4(pZLR4)和紫色桿菌CV026確定以AHL為信號(hào)分子的群體感應(yīng)系統(tǒng)。根癌農(nóng)桿菌NTL4(pZLR4)自身不產(chǎn)生AHL分子。當(dāng)存在外源AHL分子時(shí)，其β-半乳糖苷酶活性會(huì)被激活，使得培養(yǎng)基中的X-Gal被水解，從而產(chǎn)生藍(lán)色。但是，它對(duì)短鏈的AHL分子不敏感，所以使用紫色桿菌CV026作為報(bào)告菌，進(jìn)行二次檢測(cè)。紫色桿菌CV026自身不能合成C6-HSL，可通過(guò)產(chǎn)生紫色色素報(bào)告存在外源的AHL分子，特別是側(cè)鏈長(zhǎng)度為4～8個(gè)碳的 AHL 分子［6］。

通過(guò)哈維弧菌 MM32(ATCC BAA-1117，luxS，luxN)生物發(fā)光篩選以AI-2為信號(hào)分子的群體感應(yīng)系統(tǒng)。這株菌株缺少luxS合酶、luxN蛋白酶和AHL受體，且自身不產(chǎn)生DPD信號(hào)。在存在外源誘導(dǎo)物的條件下，群體感應(yīng)效應(yīng)可以被測(cè)量［7］。

2 理想群體感應(yīng)抑制劑需具備的條件

設(shè)計(jì)或?qū)ふ依硐氲娜后w感應(yīng)抑制劑需考慮以下因素［8］:①群體感應(yīng)抑制劑需是低分子質(zhì)量化合物，這種化合物可以抑制群體感應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá);②應(yīng)對(duì)群體感應(yīng)調(diào)節(jié)器有很高的特異性;③群體感應(yīng)抑制劑需對(duì)真核宿主無(wú)毒;④群體感應(yīng)抑制劑需不能干擾細(xì)菌細(xì)胞的基礎(chǔ)代謝過(guò)程如蛋白質(zhì)的合成、DNA的代謝、細(xì)胞壁的形成，否則會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性;⑤群體感應(yīng)抑制劑的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，對(duì)宿主的代謝有一定的抵抗能力，可在宿主中存在充足的時(shí)間來(lái)發(fā)揮其效力。

3 群體感應(yīng)抑制劑

群體感應(yīng)抑制劑的強(qiáng)弱依賴(lài)于其產(chǎn)生效果的濃度。根據(jù)產(chǎn)生的作用和程度，觀察抑制劑的效用。

3．1 植物精油抑制劑

3．1．1 錫蘭肉桂(Cinnamomum verum)精油。研究表明，肉桂精油有抗群體感應(yīng)能力，是長(zhǎng)鏈和短鏈AHL群體感應(yīng)系統(tǒng)的潛在抑制劑。錫蘭肉桂精油的氣相質(zhì)譜－色譜聯(lián)用結(jié)果顯示，這種精油的主要成分為反肉桂醛(72．81%)、苯甲醛(12．5%)、丁香油酚(6．57%)。其中，丁香油酚是錫蘭肉桂精油中的主要成分之一。研究表明，當(dāng)丁香油酚與抗生素一起使用于革蘭氏陰性菌中展示協(xié)同作用。在Polly Soo Xi Ya等［9］研究中，在接種量約為105CFU/ml的細(xì)菌培養(yǎng)液中，加入體積比為0．02% 的肉桂精油或體積比為0．02%肉桂精油混合濃度為256μg/ml哌拉西林。每4 h對(duì)100μl樣本進(jìn)行可行性計(jì)數(shù)，持續(xù)24 h。通過(guò)對(duì)比肉桂精油組與肉桂精油和哌拉西林混合使用組，發(fā)現(xiàn)肉桂精油對(duì)大腸桿菌J53 R1有抗菌活性，并且與哌拉西林有協(xié)同效應(yīng)。另一方面，用肉桂精油處理大腸桿菌［pSB1075］和大腸桿菌［pSB401］，使得這兩株大腸桿菌的生物發(fā)光表達(dá)減少，表明存在群體感應(yīng)抑制劑的可能性。當(dāng)肉桂精油的濃度增加時(shí)，對(duì)大腸桿菌［pSB1075］和大腸桿菌［pSB401］的抑制作用也被提升。因?yàn)榇竽c桿菌［pSB1075］和大腸桿菌［pSB401］分別攜帶有l(wèi)as R和lux R受體基因，對(duì)大腸桿菌［pSB1075］和大腸桿菌［pSB401］產(chǎn)生抑制作用則表明存在抗群體感應(yīng)活力。

通過(guò)使用陰離子洗滌劑SDS作為外膜滲透探針進(jìn)行外膜滲透試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)肉桂精油的主要作用模式為在致死或亞致死濃度破壞細(xì)菌膜系統(tǒng)，隨后增加抗生素進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞的非特異性流動(dòng)性［10－11］。這些結(jié)果表明肉桂精油不僅有透過(guò)細(xì)胞膜的能力，而且有抗群體感應(yīng)作用。

3．1．2 牛至(Oregano)精油。牛至精油的抗菌活性在與食源性病源菌相關(guān)文章中被廣泛報(bào)道。Maria等［12］首先將3 g柑橘皮果膠、0．99 ml甘油、不同濃度的牛至精油(0、15．7、25．9 和36．1 mg/ml)溶解于 100 ml水中，并均質(zhì) 15 min，接著倒入培養(yǎng)皿，在60℃下干燥24 h用于制備牛至精油果膠膜。在LB瓊脂板上布涂0．1 ml紫色桿菌(ATCC 12472)接種物;將果膠-牛至精油膜的紙片(0、15．7、25．9、36．1 mg/ml)和直接用牛至精油浸漬的紙片(0、6．25、12．5、25 mg/ml)置于LB板中;然后在30℃下培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)后，記錄在紙片周?chē)纳L(zhǎng)或產(chǎn)色抑制。結(jié)果顯示，6．25 mg/ml牛至精油、15．7 mg/ml牛至精油果膠紙片即可抑制紫色桿菌(ATCC 12472)產(chǎn)生紫色色素，且隨著濃度的提高產(chǎn)色被抑制的效果越明顯，當(dāng)精油濃度超過(guò)一定濃度時(shí)還可抑制紫色桿菌(ATCC 12472)的生長(zhǎng)。紫色桿菌(ATCC 12472)的紫色色素受群體感應(yīng)系統(tǒng)控制。紫色色素的產(chǎn)生被抑制，表明牛至精油可抑制群體感應(yīng)系統(tǒng)。

此外，通過(guò)量化紫色桿菌(ATCC 12472)色素產(chǎn)生的量，證明牛至精油有抗群體感應(yīng)活力。其方法為先將紫色桿菌接種于包含不同濃度的牛至精油或果膠－牛至精油膜的LB肉湯中，并且在30℃下培養(yǎng)24 h;再?gòu)拿總€(gè)樣本中取1 ml培養(yǎng)物，離心，沉淀不溶性紫色桿菌素;將不溶性紫色桿菌素顆粒溶解于1 ml的二甲亞砜中，渦旋直到紫色色素被提取;接著，再次離心去除細(xì)胞;在585 nm處測(cè)量含紫色色素上清液的OD值，結(jié)果表示為紫色色素產(chǎn)物的百分含量。每個(gè)試驗(yàn)的對(duì)照為不含牛至精油或果膠的LB培養(yǎng)基。對(duì)照樣本的色素產(chǎn)生設(shè)為100%。

Lambert等［13］報(bào)道了牛至精油對(duì)金黃色釀膿葡萄球菌的最小抑菌濃度為0．575 mg/ml。牛至精油的主要成分為香芹酚。Vattem等［14］曾報(bào)道了8 mmo/L的香芹酚可減少紫色桿菌的紫色桿菌素的產(chǎn)生，但不影響細(xì)菌的生存能力。試驗(yàn)證明，牛至精油抑制色素產(chǎn)生的原因可能為香芹酚抑制了編碼高絲氨酸內(nèi)酯基因表達(dá)。在以前的研究中曾報(bào)道了富含3%香芹酚的果膠膜使雞胸肉中的腸沙門(mén)氏菌和大腸桿菌157:H7(4．3～6．8 lg CFU/g)顯著減少。這些結(jié)果反映低濃度的牛至精油或添加牛至精油的果膠膜作為群體感應(yīng)抑制劑的可能性。由于精油成分的復(fù)雜性，其具體作用機(jī)制還有待探尋。大部分研究人員將香芹酚素抑制色素的產(chǎn)生與減少編碼高絲氨酸內(nèi)酯基因的表達(dá)聯(lián)系在一起。他們推測(cè)牛至精油作為群體感應(yīng)抑制劑干擾的群體感應(yīng)過(guò)程為:①信號(hào)分子生物合成或高絲氨酸內(nèi)酯信號(hào)受體的抑制;②酶活性被鈍化或群體感應(yīng)分子被生物降解。

3．1．3 阿魏(Ferula asafoetida L．)精油。在 Ehsan 等［14］報(bào)道了將25μg/ml阿魏精油加于紫色桿菌的培養(yǎng)物中可完全抑制紫色桿菌產(chǎn)生紫色色素的能力。此外，在銅綠假單胞菌中主要的3種QS系統(tǒng)分別為las、rhl和pqs系統(tǒng)。這3種系統(tǒng)影響銅綠假單胞菌的全基因組序列中6%基因的表達(dá)。這6%的基因中絕大多數(shù)與細(xì)菌特異性密度依賴(lài)的行為有關(guān)，如胞外多糖的合成、生物膜的形成、群集運(yùn)動(dòng)、抗生素的產(chǎn)生。銅綠假單胞菌的綠膿菌素是一個(gè)受QS系統(tǒng)控制的因素，主要由las系統(tǒng)調(diào)節(jié)。通過(guò)測(cè)量從穩(wěn)定生長(zhǎng)期銅綠假單胞菌中制備的樣本在520 nm處的光密度值，發(fā)現(xiàn)阿魏精油顯著地抑制綠膿菌素產(chǎn)物，表明阿魏精油抑制las系統(tǒng)。也有人提出質(zhì)疑，認(rèn)為綠膿菌素產(chǎn)物間接地受到培養(yǎng)基pH或鐵濃度的影響。經(jīng)檢測(cè)，在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，培養(yǎng)基pH無(wú)變化。同時(shí)，通過(guò)測(cè)量樣品中的鐵載體、彈性蛋白酶、結(jié)晶紫在405、495、650 nm處的光密度值，發(fā)現(xiàn)阿魏精油使得銅綠假單胞菌的鐵載體、彈性蛋白酶產(chǎn)物和生物膜的形成減少［15］。這也說(shuō)明阿魏精油可作為新型群體感應(yīng)抑制劑。

3．1．4 白草(Lippia alba)精油。Jesus 等［16］利用紫色桿菌CV026研究了白草中分離的5種精油對(duì)其生長(zhǎng)的影響和潛在的抗群體感應(yīng)活力。首先將精油溶解于二甲基亞砜中，然后加入無(wú)菌培養(yǎng)基中，使得最終濃度分別為0．01、0．1、10、100、200、300μg/ml，再采用肉湯稀釋法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的情況，將等體積的紫色桿菌CV026置于不同濃度的精油和純二甲基亞砜(對(duì)照)中，然后置于30℃下培養(yǎng)18 h，在620 nm處測(cè)量其吸光度值。結(jié)果顯示，相對(duì)于溶劑對(duì)照組，5種白草精油都顯著地抑制了紫色桿菌的生長(zhǎng)，并且其中的兩種精油的抑菌效果隨其濃度的增加更為顯著。

另一方面，通過(guò)向紫色桿菌CV026外源添加C6-HSL信號(hào)分子測(cè)試白草精油的抗群體感應(yīng)能力。首先將過(guò)夜培養(yǎng)的紫色桿菌CV026的光密度值(OD620)調(diào)整至0．1;從中取出100μl細(xì)菌培養(yǎng)液加入到含有890μl的LB介質(zhì)、5μl的C6-HSL(15 mmol/L)和 5 μl濃度分別為0．01、0．1、10、100、200和300μg/ml精油的無(wú)菌離心管中(對(duì)照組為加入5μl二甲基亞砜)。最后，包上鋁箔，在有氧的情況下培養(yǎng)24 h。研究結(jié)果顯示，來(lái)自白草的兩種精油是有效的群體感應(yīng)抑制劑。其中一種包含最大檸檬醛——橙花醛，另一種包含最大檸檬烯和香芹酮，且這兩種精油對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用很小。

采用紙片擴(kuò)散法在金黃色葡萄球菌ATCC 25923中使用香葉醛/橙花醛型精油，發(fā)現(xiàn)10和5μl純精油可產(chǎn)生最大生長(zhǎng)抑制區(qū)域。這些數(shù)據(jù)表明來(lái)自白草的精油對(duì)金黃色葡萄球菌有抗菌活性，且有望成為群體感應(yīng)抑制劑［16］。但是，由于白草精油有一種或幾種主要的成分和許多種次要成分。因此，這些混合物對(duì)群體感應(yīng)系統(tǒng)的具體作用模式是復(fù)雜的。盡管可以推測(cè)精油中的主要成分與次要成分之間有協(xié)同作用，還需要對(duì)其具體作用機(jī)制進(jìn)行更加深入的研究。

3．2 呋喃型 呋喃型群體感應(yīng)抑制劑活力和其抑制機(jī)制已被深入研究。據(jù)報(bào)導(dǎo)，已從海洋水藻D．pulchra中獲得鹵化呋喃酮。它們可保護(hù)水藻免受海洋細(xì)菌的黏附和淤積［17］。天然化合物(5Z)-4-bromo-5-(bromomethylene)-3-butyl-2(5H)-furanone也被稱(chēng)為呋喃酮1。研究顯示，呋喃酮1在對(duì)浮游生物生長(zhǎng)無(wú)影響的濃度下，可以抑制大腸桿菌聚集和生物膜形成?；贏HL和以自體誘導(dǎo)物2為信號(hào)分子的群體感應(yīng)系統(tǒng)都可被呋喃酮抑制。由于呋喃酮這一類(lèi)分子與這兩種群體感應(yīng)的信號(hào)分子在結(jié)構(gòu)上相似，原先人們認(rèn)為呋喃酮的抑制機(jī)理為與自體誘導(dǎo)物競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合其受體。近年來(lái)研究顯示，鹵化呋喃酮的抑制機(jī)理為破壞且促進(jìn)費(fèi)氏弧菌和哈維氏弧菌的luxR蛋白的轉(zhuǎn)變。這削弱了luxR與DNA的結(jié)合和發(fā)起轉(zhuǎn)錄的能力。研究證明，呋喃酮4可以提高銅綠假單胞菌生物膜對(duì)托普霉素的敏感性。溴化呋喃酮對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和真菌有效［18］。

3．3 群體感應(yīng)淬滅酶 AHL-內(nèi)酯酶、AHL-?；D(zhuǎn)移酶、對(duì)氧磷酶(paraoxonases，PONs)可降解群體感應(yīng)信號(hào)分子。AHL-內(nèi)酯酶可水解AHL的內(nèi)酯環(huán)，且AHL-內(nèi)酯酶已從多種細(xì)菌代謝產(chǎn)物中分離得到。通過(guò)大腸桿菌的功能性克隆確定了AHL-內(nèi)酯酶由AiiA基因編碼。內(nèi)酯酶是一種金屬蛋白，在活性部位有2個(gè)金屬鋅離子。在這種酶中，除鋅以外的殘基用于維持活性部位構(gòu)象。AHL?；D(zhuǎn)移酶水解AHLs的酰胺結(jié)合鍵，從而降解AHL信號(hào)。產(chǎn)物為脂肪酸分子和高絲氨酸內(nèi)酯。對(duì)氧磷酶類(lèi)可水解AHL信號(hào)的高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)。對(duì)對(duì)氧磷酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)研究和誘變研究，發(fā)現(xiàn)這3種酶PON1、PON2和PON3顯示了重疊的結(jié)構(gòu)特征，但對(duì)底物的特異性不同［19］。

3．4 高絲氨酸內(nèi)酯(homo serine lactone，HSL)類(lèi)似物 這些分子是群體感應(yīng)信號(hào)分子的類(lèi)似物，可與信號(hào)分子競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合受體，阻礙群體感應(yīng)。HSL類(lèi)似物已被證實(shí)可抑制金黃色釀膿葡萄球菌形成生物膜。使用3種群體感應(yīng)報(bào)告菌株根癌農(nóng)桿菌(含TraR質(zhì)粒)、銅綠假單胞菌(含LasR質(zhì)粒)、費(fèi)氏弧菌(含LuxR質(zhì)粒)進(jìn)行AHL數(shù)據(jù)庫(kù)篩選。使用基于gfp報(bào)告基因構(gòu)建報(bào)告菌株，可構(gòu)建HSL類(lèi)似物數(shù)據(jù)庫(kù)，同時(shí)進(jìn)行AHL抑制劑的篩選。群體感應(yīng)抑制劑分子可使gfp報(bào)告基因的表達(dá)減少50%或更多。使用自體誘導(dǎo)物的局限性在于以下兩點(diǎn):①大多數(shù)HSL類(lèi)似物可與HSL分子競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合受體位點(diǎn)所需的濃度;②可能存在副作用。由于HSLs通常作為免疫抑制劑，HSLs的類(lèi)似物可能使病人的免疫力降低［20］。

3．5 AI-2的類(lèi)似物 這些類(lèi)似物可與QS信號(hào)競(jìng)爭(zhēng)且阻塞內(nèi)生性QS信號(hào)與其受體的結(jié)合。AI-2的C-1烷基類(lèi)似物被報(bào)道競(jìng)爭(zhēng)性與lsrR調(diào)節(jié)器結(jié)合而作為群體感應(yīng)抑制劑。盡管這些群體感應(yīng)抑制劑可廣泛用于多種細(xì)菌，它們?nèi)詫?duì)一些目標(biāo)細(xì)菌顯示出很高的選擇性。一些烷基類(lèi)似物對(duì)大腸桿菌有特異性，其中只有丁基-和異丁基-DPD抑制鼠傷寒沙門(mén)氏菌的信號(hào)分子，盡管來(lái)自這兩種細(xì)菌的lsrR蛋白享有高度的同源性和相似的折疊結(jié)構(gòu)［21］，硼酸和DPD類(lèi)似物已被用作AI-2的拮抗劑。

3．6 肽和抗體 從金黃色葡萄球菌IV型中合成的小肽以劑量依賴(lài)方式抑制金黃色葡萄球菌I型agr基因的表達(dá)。相似的，人們?cè)O(shè)計(jì)了一種小肽分子。這種小肽分子對(duì)4種類(lèi)型的金黃色葡萄球菌都可產(chǎn)生作用，以此作為金黃色葡萄球菌的廣譜群體感應(yīng)抑制劑。抑制RNAIII的肽對(duì)耐藥性葡萄球菌中以agr介導(dǎo)的生物膜形成有抑制作用［22］。群體感應(yīng)信號(hào)的抗體對(duì)群體感應(yīng)過(guò)程有阻礙作用。通過(guò)接種含AI-1信號(hào)分子的疫苗，并由此產(chǎn)生抗體。這種抗體可干擾群體感應(yīng)，并在小鼠對(duì)抗銅綠假單胞菌感染肺部的過(guò)程中保護(hù)小鼠。

4 展望

近年來(lái)大量研究工作在篩選群體感應(yīng)抑制劑和探索群體感應(yīng)抑制劑機(jī)制中展開(kāi)，目的是為尋找有效的群體感應(yīng)抑制劑?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種來(lái)自植物的精油有群體感應(yīng)抑制效果。來(lái)自植物的精油成分天然，更加安全，更易獲取，展示在食品行業(yè)中控制微生物污染的前景。隨著群體感應(yīng)抑制劑的作用機(jī)制被更加深入地研究，在不遠(yuǎn)的將來(lái)更多天然、無(wú)毒、有效的群體感應(yīng)抑制劑將被開(kāi)發(fā)和投入生產(chǎn)，使其成為控制人類(lèi)、動(dòng)物和植物病原菌污染的有效選擇，并且造福農(nóng)業(yè)、漁業(yè)、造紙業(yè)等易受微生物污染的行業(yè)，發(fā)揮其不可替代的作用。

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