代 軍

(遼寧民族師范高等專科學(xué)校，遼寧阜新 123000)

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Southern雜交技術(shù)在農(nóng)作物遺傳轉(zhuǎn)化研究中的應(yīng)用

代 軍

(遼寧民族師范高等?？茖W(xué)校，遼寧阜新 123000)

Southern雜交技術(shù)作為分子生物學(xué)中的經(jīng)典技術(shù)，為特定DNA片段的檢測提供了快速、準(zhǔn)確、靈敏的方法。在植物遺傳轉(zhuǎn)化研究中，Southern雜交技術(shù)廣泛應(yīng)用于外源基因的檢測及拷貝數(shù)的鑒定工作，為植物轉(zhuǎn)基因研究的準(zhǔn)確性提供了充分的保障。綜述了Southern雜交技術(shù)在水稻、玉米、小麥、大豆等主要農(nóng)作物遺傳轉(zhuǎn)化研究中的應(yīng)用，可為農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因研究方法的明確及轉(zhuǎn)基因食品安全檢測方法的探索提供參考。

Southern雜交；農(nóng)作物；遺傳轉(zhuǎn)化；外源基因檢測

Southern雜交技術(shù)由英國科學(xué)家埃德溫·邁勒·薩瑟恩(E.M.Southern)于1975年創(chuàng)立，此技術(shù)現(xiàn)已成為檢測特定DNA片段的經(jīng)典方法[1]。該方法利用硝酸纖維膜或尼龍膜等可以吸附DNA的功能，將DNA電泳后的DNA區(qū)帶吸附到膜上，隨后在膜上進(jìn)行同位素標(biāo)記探針與被測DNA之間的雜交，最后通過放射自顯影對雜交結(jié)果進(jìn)行檢測，以此探測DNA 樣品中含有的特定DNA信息[2]。Southern雜交技術(shù)特異性強(qiáng)，靈敏性高，可應(yīng)用于檢測樣品中DNA及其含量，了解基因的狀態(tài)，如是否存在點突變、擴(kuò)增重排等，在遺傳病診斷、外源基因檢測、DNA圖譜分析、PCR產(chǎn)物分析等方面均有廣泛應(yīng)用。隨著Southern雜交技術(shù)的不斷成熟，其越來越多地被應(yīng)用到農(nóng)作物基因工程基礎(chǔ)研究和轉(zhuǎn)基因育種中。

《種子法》規(guī)定，水稻、小麥、玉米、棉花、大豆為主要農(nóng)作物。此外，油菜和馬鈴薯也被列為主要農(nóng)作物的范疇。筆者針對主要農(nóng)作物，綜述了Southern雜交技術(shù)的應(yīng)用情況，旨在總結(jié)Southern雜交技術(shù)在作物分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究和遺傳育種中的主要作用及趨勢，為更清晰地了解和利用Southern雜交技術(shù)提供重要參考。

1 Southern雜交技術(shù)在水稻中的應(yīng)用

水稻(OryzasativaL.)是世界上最重要的糧食作物之一，由于其基因組相對較小，遺傳轉(zhuǎn)化體系成熟，已逐漸成為作物分子遺傳及基因組研究的模式植物[3]。Southern雜交技術(shù)在水稻基因工程研究中起著十分重要的作用，是轉(zhuǎn)基因水稻最為重要的一種檢測手段[4]。孫崇榮等[5]利用32P標(biāo)記的探針進(jìn)行Southern雜交，驗證了水稻葉綠體基因也能編碼自身的RNA聚合酶。李寶健等[6]利用電注射法導(dǎo)入外源基因獲得轉(zhuǎn)基因水稻植物，通過Southern雜交技術(shù)，證實了外源基因在此轉(zhuǎn)化體系中得到了穩(wěn)定的表達(dá)。GUS基因在水稻中的表達(dá)[7]、轉(zhuǎn)抗菌肽B基因[8]、抗除草劑轉(zhuǎn)基因水稻[9]、GUS和HPT基因在水稻中的共表達(dá)[10]等都是通過Southern雜交技術(shù)來驗證其轉(zhuǎn)入的整合穩(wěn)定性。金危危等[11]，徐曉輝[12]，王嶸等[13]，王為民等[14]，張啟軍等[15]，李聰?shù)萚16]，汪小福等[17]，羅伯祥等[18]，向殿軍等[19]在水稻轉(zhuǎn)基因等方面的研究也是利用Southern雜交技術(shù)作為主要手段進(jìn)行外源基因檢測的。此外，電注射法、低能離子束介導(dǎo)法[20]、基因槍法[21]、水稻花粉管導(dǎo)入法[22]、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法[23-26]等轉(zhuǎn)基因方法的發(fā)明與完善，都是利用Southern雜交技術(shù)進(jìn)行驗證的。

2 Southern雜交技術(shù)在玉米中的應(yīng)用

玉米(ZeamaysL.)是我國第一大糧食作物，對糧食和飼料生產(chǎn)起著舉足輕重的作用[27]。1986年Frommd等[28]用電擊法將除草劑pat基因轉(zhuǎn)入玉米原生質(zhì)體，開創(chuàng)了玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)的先例。1990年Gordon-Kamm等[29]首次獲得了可育的轉(zhuǎn)基因玉米。隨著轉(zhuǎn)基因玉米技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，通過基因槍法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、花粉管通道法、聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)法等主要遺傳轉(zhuǎn)化方法，研究人員已將諸多功能基因成功轉(zhuǎn)入玉米，后續(xù)功能研究過程均采用了PCR法和Southern雜交技術(shù)對目的基因進(jìn)行了驗證。劉小紅等[30]利用基因槍法將玉米矮花葉病毒外殼蛋白基因?qū)胗衩變?yōu)良自交系，通過Southern雜交技術(shù)驗證了CP基因已成功整合到玉米自交系基因中；黃璐等[31]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法建立了成熟的遺傳轉(zhuǎn)化體系，利用Southern雜交技術(shù)證實了外源基因的轉(zhuǎn)入。李茫雪等[32]利用花粉管通道法將Bt-CPTI雙價抗蟲基因轉(zhuǎn)入優(yōu)良玉米自交系中，對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行Southern雜交檢測，證明外源基因已整合到玉米基因組中。劉銅等[33]利用PEG介導(dǎo)法建立了玉米彎孢葉斑病菌原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化體系，通過Southern雜交技術(shù)對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了驗證。常規(guī)的Southern雜交技術(shù)一般采用同位素標(biāo)記的方法進(jìn)行雜交信號檢測，但同位素具有強(qiáng)輻射特點，存在一定的安全隱患，近年來研究大都采用更加安全、高效的地高辛標(biāo)記方法進(jìn)行雜交檢測。王艷輝等[34]，李京等[35]，徐曉露[36]，劉強(qiáng)等[37]，均利用地高辛標(biāo)記方法對轉(zhuǎn)基因植株的外源基因進(jìn)行了Southern雜交檢測。此外，地高辛標(biāo)記的Southern雜交技術(shù)與PCR技術(shù)相結(jié)合的PCR-Southern雜交技術(shù)也得到了廣泛應(yīng)用[38]。

3 Southern雜交技術(shù)在大豆中的應(yīng)用

大豆蛋白質(zhì)含量豐富，是唯一能替代動物蛋白的植物性食品。相對于水稻而言，大豆的遺傳轉(zhuǎn)化率相對較低，Southern雜交技術(shù)鑒定其拷貝數(shù)，整合完整性等已成為基礎(chǔ)技術(shù)。徐香玲等[39]用PCR 檢測和Southern雜交技術(shù)，鑒定大豆轉(zhuǎn)基因植株呈陽性，證明了外源基因已導(dǎo)入并整合到大豆基因組中；王振華等[40]對轉(zhuǎn)基因大豆T0代植株進(jìn)行Southern雜交分析，證明了nptⅡ基因成功轉(zhuǎn)入；郝青南[41]利用Southern 雜交技術(shù)，證實了大豆基因Gmduf-cbs和Gmdof1.4已成功整合到擬南芥基因組中。宋冰[42]通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將大豆C2H2型鋅指蛋白基因SCTF-1、STF-2、STF-3分別轉(zhuǎn)入煙草中，同時通過花粉管通道法導(dǎo)入大豆中，并進(jìn)行Southern雜交鑒定，結(jié)果表明目的基因已成功整合到煙草和大豆基因組中。陸鴻玲等[43]建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)、草胺膦為篩選劑的大豆轉(zhuǎn)基因體系，通過Southern雜交等方法對轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)行了分子檢測和驗證，最后獲得了分子特征明確、對草甘膦抗性穩(wěn)定的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆后代。付永平等[44]和郭佩佩[45]也采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別將大豆基因轉(zhuǎn)入模式植物煙草中，并用Southern雜交證實了目的基因已成功整合到煙草基因組中，對進(jìn)一步研究該基因?qū)Υ蠖沟挠绊懽隽思夹g(shù)保障。李明春等[46]、李勃[47]、張云月等[48]、范素杰等[49]、王丹等[50]、藍(lán)嵐等[51]、賀海生[52]、章潔瓊等[53]和張琳等[54]等都利用Southern雜交技術(shù)證實了目的基因已成功整合到大豆基因組中。

4 Southern雜交技術(shù)在小麥中的應(yīng)用

小麥?zhǔn)亲钪匾募Z食作物之一，是人類蛋白質(zhì)的主要攝取來源。作為六倍體作物，小麥擁有較為龐大的基因組，相對水稻而言其轉(zhuǎn)基因研究相對滯后。1992年第一株轉(zhuǎn)基因小麥的報道，是小麥轉(zhuǎn)基因研究的里程碑，此后許多學(xué)者利用不同方法將不同目的基因?qū)胄←?，獲得轉(zhuǎn)基因小麥，在檢測外源基因?qū)氲倪^程中，很多均采用了Southern雜交的方法[55]。張曉東等[56]利用基因槍法將除草劑Basta抗性基因與小麥HMW谷蛋白亞基基因?qū)胄←湯@得轉(zhuǎn)基因植株，應(yīng)用點雜交和Southern雜交技術(shù)對目的基因進(jìn)行了檢測；劉寶等[57]利用Southern雜交技術(shù)證實擴(kuò)增的7B染色體DNA源自小麥基因組，并鑒定了基因拷貝數(shù)；于洪欣等[58]利用Southern雜交技術(shù)結(jié)合PCR檢測證實了抗蟲基因(CpTI)整合到小麥基因組中。進(jìn)入21世紀(jì)后，轉(zhuǎn)基因小麥研究逐漸增多，Southern雜交技術(shù)的應(yīng)用更加廣泛。吳麗芳等[59]首次用低能離子束介導(dǎo)法將GUS基因轉(zhuǎn)入小麥，并用Southern雜交技術(shù)鑒定目的基因已成功整合到小麥基因組中。徐瓊芳等[60]用基因槍法獲得轉(zhuǎn)GNA和bar基因的小麥植株，并用Southern雜交技術(shù)加以鑒定。劉偉華等[61]利用基因槍法以菜豆幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)化小麥幼胚愈傷組織，經(jīng)PCR和PCR-Southern雜交分析，證實菜豆幾丁質(zhì)酶基因已整合到T0和T1小麥基因組中。劉錄祥等[62]也利用基因槍法將DREB1A和bar基因轉(zhuǎn)入小麥，通過PCR和Southern 雜交分析，已獲得含目的基因的轉(zhuǎn)基因小麥植株。此外，在小麥遺傳轉(zhuǎn)化研究中，奚亞軍等[63]轉(zhuǎn)葉片衰老抑制基因PSAG12-IPT、侯文勝等[64]轉(zhuǎn)sgna基因、路研等[65]轉(zhuǎn)Rs-AFP2基因、趙同金等[66]轉(zhuǎn)大麥Mlo反義基因、劉欣等[67]轉(zhuǎn)TaPIEP1基因、劉香利等[68]轉(zhuǎn)麥谷蛋白亞基基因、張建紅等[69]轉(zhuǎn)pepc基因和余桂紅等[70]轉(zhuǎn)高賴氨酸蛋白基因，都用Southern雜交技術(shù)對目的基因是否成功整合到小麥基因組中做了進(jìn)一步鑒定。

5 Southern雜交技術(shù)在其他農(nóng)作物中的應(yīng)用

除上述幾種主要農(nóng)作物，在油菜、馬鈴薯、棉花等其他農(nóng)作物遺傳轉(zhuǎn)化研究中，Southern雜交技術(shù)的應(yīng)用同樣較為廣泛。油菜是位列大豆和棉花之后的第三大油料作物，屬十字花科蕓薹屬，其轉(zhuǎn)基因研究包括轉(zhuǎn)入抗除草劑基因、抗病基因、抗蟲基因等。王伏林[71]通過根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將pCambia-ABCD基因轉(zhuǎn)入油菜抗潮霉素再生苗中，并用Southern雜交技術(shù)進(jìn)行檢測，結(jié)果證實該基因已成功轉(zhuǎn)入，且該基因在甘藍(lán)型油菜及其近緣種的基因組中呈單拷貝。吳玉俊等[72]在轉(zhuǎn)ChIFN-γ基因油菜植株中通過ELISA定量檢測、PCR檢測及Southern雜交檢測，確定了外源基因的導(dǎo)入。馬鈴薯是重要的糧食作物，具有多種經(jīng)濟(jì)用途。但馬鈴薯易感染病害，易受干旱影響，所以將抗蟲基因、抗旱基因、耐鹽堿基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯的研究較常見[73]。侯書國[74]將GNA基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯，對轉(zhuǎn)化后的馬鈴薯進(jìn)行PCR-Southern檢測和抗除草劑鑒定，證明GNA基因已整合到馬鈴薯基因組。潘映雪[75]以馬鈴薯品種克新18號和東農(nóng)303的脫毒微型薯為研究對象，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將抗旱基因BDN1轉(zhuǎn)入馬鈴薯，經(jīng)PCR和Southern雜交檢測，證明BDN1基因已轉(zhuǎn)入馬鈴薯基因組中。張正國[76]以馬鈴薯品種費烏瑞它的脫毒微型薯為外植體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將BADH耐鹽相關(guān)基因?qū)腭R鈴薯，經(jīng)Southern檢測，證明BADH基因己轉(zhuǎn)入馬鈴薯基因組中。棉花是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物和纖維作物，也是我國較早開展轉(zhuǎn)基因育種的作物之一。劉正杰[77]應(yīng)用花粉管通道法研究內(nèi)源基因GhDGAT1沉默對棉花油分含量的影響，Southern雜交結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因種子中該基因表達(dá)量受到顯著抑制。楊云堯[78]利用花粉管通道法將抗逆相關(guān)基因轉(zhuǎn)化到棉花中，Southern雜交技術(shù)檢測結(jié)果顯示T3代轉(zhuǎn)基因棉花中的MvNHXY基因和MvP5CS基因以單拷貝的形式插入到棉花基因組中。

Southern雜交技術(shù)除在基因工程方面的應(yīng)用廣泛外，在鑒定近緣種屬同源性、鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及鑒定特異重復(fù)序列等方面也有重大貢獻(xiàn)。王蘇玲等[79]根據(jù)Southern雜交結(jié)果，推測出百薩偃麥草可能參與了賴草屬物種的形成過程。溫亞麗等[80]通過Southern 雜交試驗證明毛木耳和紫木耳之間存在較高的同源性，從而進(jìn)一步證實了在基因組進(jìn)化上，紫木耳與毛木耳的關(guān)系較黑木耳更為密切。孫瑞芬等[81]用內(nèi)葵雜3號三交種和單交種各自的基因組DNA標(biāo)記成探針，與隨體染色體擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Southern雜交，顯示雜交信號，證明內(nèi)葵雜3號三交種和單交種隨體染色體DNA已被成功擴(kuò)增。陳林剛等[82]通過Southern 雜交技術(shù)對RHS1、RHS2、RHS3、RHS4、RHS5、RHS6、RHS7、RHS8、RHS9、RHS10和RHS11重復(fù)序列進(jìn)行序列特異性檢測，結(jié)果表明RHS3、RHS5、RHS8為華山新麥草基因組特異重復(fù)序列。

6 小結(jié)

Southern雜交技術(shù)在水稻、玉米、大豆、小麥、油菜等農(nóng)作物遺傳轉(zhuǎn)化研究中的應(yīng)用較為廣泛，是檢測外源基因?qū)氲闹匾侄?。隨著農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，將會有越來越多的具備優(yōu)良性狀的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物問世。伴隨著轉(zhuǎn)基因食品安全性爭議的持續(xù)發(fā)酵，快速準(zhǔn)確的檢測轉(zhuǎn)基因成分也將成為農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因研究的重點內(nèi)容，這就要求研究人員更好地利用和完善Southern雜交、PCR等技術(shù)，使之為農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因研究的穩(wěn)步推進(jìn)作出更大的貢獻(xiàn)。

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Application of Southern Blot in the Genetic Transformation of Crops

DAI Jun

(Liaoning National Normal College, Fuxin, Liaoning 123000)

As one of classical techniques of molecular biology, Southern blot provides a fast, accurate and sensitive method for the detection of specific DNA fragments. In the research of genetic transformation in plants, Southern blot is widely used in the detection of genetic transformation and identification of gene copy number. It provides adequate safeguards for the accuracy of transgenic research. This paper summarizes the application of Southern blot in the staple crops, such as rice, maize, wheat, soybean, etc., which provides references for the definitude of the ways for studying genetic transformation, as well as the explore of the ways for detecting genetically modified food safety.

Southern blot; Crops; Genetic transformation; Detecting exogenous gene

國家林業(yè)公益性行業(yè)專項資助項目(200904064)。

代軍(1965- )，女，遼寧阜新人，副教授，從事農(nóng)業(yè)生物技術(shù)方面的研究。

2014-11-12

S 188

A

0517-6611(2015)01-020-04